優良野生葡萄酒酵母的篩選及性能評價*

陳金麗，郭陽，薛潔，鄭君，趙彩云

1(中國食品發酵工業研究院，北京，100027)

2(中糧華夏長城葡萄酒有限公司，河北昌黎，066600)

優良野生葡萄酒酵母的篩選及性能評價*

陳金麗1，郭陽1，薛潔1，鄭君2，趙彩云1

1(中國食品發酵工業研究院，北京，100027)

2(中糧華夏長城葡萄酒有限公司，河北昌黎，066600)

以河北昌黎葡萄酒產區4個不同品種的葡萄為野生酵母分離源，分離到了58株酵母。以此作為出發菌株，通過酒精耐受性試驗、SO2耐受性試驗、模擬發酵試驗，以發酵力、發酵速率、糖利用率等為標準初步篩得4株具有應用價值的野生酵母。用這4株酵母在酒廠進行了小型的葡萄酒發酵試驗，將所得酒樣進行理化分析及感官品評，并采用氣-質聯用儀(GC-MS)分析其香氣成分，最終獲得了對這4株酵母發酵性能的綜合評價，認為其中2株具有應用于生產的潛能。

野生酵母，發酵試驗，感官品評，GC-MS

葡萄酒的風格不僅取決于葡萄品種和釀造工藝，而且與酵母等微生物的發酵作用密切相關。酵母菌作為葡萄酒發酵過程中最重要的生產菌，直接影響所釀葡萄酒的質量，因此為獲得優質葡萄酒，選用適宜的釀酒酵母是非常重要的，酵母菌株是葡萄酒品質的重要保證[1］。目前國內葡萄酒市場產品同質化現象嚴重，主要是由葡萄原料、釀造工藝等相同或相似造成的，還有一個不可忽視的重要原因就是絕大多數葡萄酒企業在生產過程中使用相同的商業活性干酵母，這在無形之中又使產品同質化現象更趨嚴重，由此針對不同葡萄品種，選擇適宜酵母可有效解決產品同質化問題。在傳統的葡萄和葡萄酒產區，野生酵母逐漸適應了當地的氣候、土壤和葡萄品種，再加上自然選擇的作用，逐漸形成了適應當地葡萄酒的菌系。所以，傳統葡萄園釀出的美酒，具有很強的甚至獨一無二的地方特性[2］。因此要生產高品質的特色葡萄酒，優良產地野生酵母的篩選就變的十分必要。

有研究表明，不同酵母菌株在發酵原料相同的情況下所釀葡萄酒的風味會呈現一定程度的差別，這是因為不同酵母菌合成及釋放揮發性香氣成分的能力不同[3］。目前國內外優良酵母菌株的篩選基本上僅僅考慮其耐受力、發酵力、發酵速率等基本的釀造性能[4］，而葡萄酒風味則不予以考慮或沒有一種明確的方法。本研究除考慮酵母的基本發酵性能外，還將葡萄酒的風味作為酵母性能的重要指標，通過有效的儀器分析，建立一種比較全面的篩選、評價葡萄酒酵母的方法，為今后野生酵母的篩選工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 野生酵母菌株的分離原料

河北昌黎葡萄酒產區的赤霞珠(Cabernet Sauvignon)，西拉(Shiraz)，美樂(Merlot)，品麗珠(Cabernet Franc)共4個品種的紅葡萄原料。

1.1.2 培養基

初步分離純化用培養基:麥芽汁培養基(自制);分類用培養基:WL培養基;保藏用培養基:YPD培養基(固體);耐受性試驗用培養基:液體YPD培養基為基本成分。其余培養基根據具體實驗條件調整。

1.1.3 儀器及試劑

溫度梯度PCR儀(Gene Company Limited，中國香港)，電泳儀(Baygene Biotech Company Limited，美國)，凝膠成像系統(Kodak，美國)，配有EI離子源的Clarus600氣相色譜-質譜聯用儀(Perkin Elmer，美國)，電子天平(Mettler Toledo，瑞士)，恒溫水浴鍋(杭州雪中炭恒溫技術有限公司，中國)，固相微萃取裝置配有 SPME手柄(Supelco，美國)，50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取頭(Supelco，美國);通用引物NL1/NL4(生工生物(上海)有限公司)，10×PCR buffer、TaqDNA聚合酶、dNTPs等(生工生物(上海)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 野生酵母菌株的初步分離

在葡萄園中剪取接近成熟的整穗葡萄放于無菌封口袋中，實驗室中采取無菌手段從整穗葡萄的上、中、下及里側、外側摘取葡萄50粒，于無菌封口袋中破碎混勻后常溫放置1h。取混勻的葡萄汁0.1 mL涂布于麥芽汁培養基上，25℃條件下靜置培養2d。挑取典型的酵母菌落，并進行2～3次的純化，保存于YPD試管斜面上。

1.2.2 優良酵母菌的初篩

1.2.2.1 酵母菌株的酒精耐受性試驗

配置液體YPD培養基，滅菌后添加無水乙醇，使其終濃度達到8%。將初步分離的酵母菌于液體YPD培養基中活化，接入以上培養基中，25℃條件下靜置培養2d，觀察酵母菌的生長情況，將能夠正常生長的酵母菌株再依次接入乙醇含量10%、12%、14%、16%的YPD培養基中，培養后觀察其生長情況。由于絕大部分干紅葡萄酒的酒度在12°左右，一般不會超過15°，據此將酒精耐受力達到16%作為酵母的篩選標準，將酒精耐受力達到16%的菌株做進一步的SO2耐受性實驗。

1.2.2.2 酵母菌的SO2耐受性試驗

配置液體YPD培養基，滅菌后按照總SO250 mg/L的量添加亞硫酸，將菌株接入其中，25℃條件下靜置培養2 d，觀察酵母菌生長情況，然后將能夠正常生長的酵母菌再依次接入總SO2添加量為100、150、200 mg/L的YPD液體培養基中，觀察其生長情況。在實際的生產過程中添加的總SO2一般不超過100 mg/L，但會根據原料、工藝等做出調整，考慮到實際條件及前人的研究，將SO2耐受力達到200 mg/L的菌株作為進一步篩選評價的出發菌株[5］。

1.2.3 初篩菌株的鑒定

1.2.3.1 WL培養基初步分類鑒定

研究表明，WL培養基可以對一些常見的葡萄酒相關酵母進行分類和鑒定，不同酵母可以在此培養基上呈現不同的菌落形態[6］，據此可以利用WL培養基對初篩菌株做初步的鑒定。將初步篩得的酵母全部以劃線法接于WL平板上，25℃條件下靜置培養兩天，然后觀察其菌落特征。

1.2.3.2 26SrDNA D1/D2區域特異性序列分析法鑒定

酵母菌的傳統鑒定方法主要依據形態、生理生化等特征，但這些方法測試項目多，耗費時間長，且易受培養條件的影響而出現不確定的結果。經研究表明，以26S rDNA D1/D2區域序列分析為代表的分子生物學鑒定方法可以將絕大部分的酵母從種的水平區分開來，這些方法具有快速、準確的優勢[7］。本研究中，采用玻璃珠破壁法提取酵母基因組DNA，具體方法參考文獻[8］。然后用瓊脂糖凝膠電泳(0.8%瓊脂糖凝膠，8 V/cm，50 min)檢測基因組DNA的提取效果，如果符合模版要求，便以此為模版，以NL1(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3')和NL4(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3')為引物擴增26S rDNA D1/D2 區域[7］14。用電泳(1% 瓊脂糖凝膠，7V/cm，40min)檢驗擴增結果，將擴增片段送交生工生物(上海)有限公司測序，利用 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的 BLAST 將測序結果與Gen Bank數據庫中的序列進行同源性比對，最后將比對結果和WL培養基鑒定結果相結合實現初篩酵母菌株的鑒定，選出釀酒酵母，篩除非釀酒酵母。

1.2.4 實驗室發酵試驗

1.2.4.1 發酵試驗(一)

配制改良的YPD培養基(酵母粉1%、葡萄糖20%、蛋白胨2%)充當發酵液，在每個帶有發酵栓的三角瓶中加入150 mL培養基，將初篩菌株及企業使用的菌株“釀”活化后接入其中，以“釀”作為對照，使其終濃度達到5×105個/mL。利用CO2失重法，發酵過程中每天早晚2次稱重，直至2次重量差＜0.2 g視為發酵終點。觀察其發酵力、發酵速率及糖的利用率，并據此篩選菌株。

1.2.4.2 發酵試驗(二)

由于使用YPD模擬的葡萄發酵醪與實際葡萄汁的組成有很大的區別，為盡可能接近實際生產，選取企業保存的經過巴氏滅菌的葡萄汁(理化指標為:還原糖216.2 g/L，總酸10.4 g/L，pH 3.40)進行第二次的發酵試驗，在每個帶有發酵栓的三角瓶中加入100 mL上述葡萄汁，將初篩菌株及企業提供的菌株“釀”、“農”活化后接入其中，以“釀”、“農”作為對照，使其終濃度達到5×105個/mL。利用CO2失重法，發酵過程中每天稱重，直至兩次重量差＜0.2 g視為發酵終點，根據其發酵力、發酵速率、糖利用率等進一步篩選菌株。

1.2.5 葡萄酒廠小型發酵試驗

在企業的發酵罐中取破碎處理好的且未添加酵母的葡萄發酵醪(理化指標為:還原糖263.1 g/L，總酸8.1 g/L，pH 3.80，添加總SO2約60 mg/L)于10 L瓶內，將前期篩得的酵母活化后加入葡萄汁中，并以企業提供的2株酵母“釀”、“農”為對照，使其終濃度達到106個/mL，室溫(22℃)下按照紅葡萄酒的釀造工藝進行發酵。每天打比重觀察發酵進度，酒精發酵結束后，測其理化指標。

待酒樣穩定后，裝瓶，進行感官品評。品評人員分兩組，專家組和普通消費者組，分別從香氣、口感等方面進行打分[9］。然后采用氣-質聯用儀，對每種酒樣的香氣成分進行分析[10-11］。

2 結果與分析

2.1 野生酵母菌株的分離及初篩

利用麥芽汁培養基初步得到了58株純化的酵母菌株。在分離酵母菌株的過程中發現:接近成熟且健康的葡萄表面的主體微生物是酵母和霉菌，種類繁多，且相近地域、不同品種的葡萄原料之間微生物構成差別不大。

根據確定的篩選標準，通過酒精耐受性試驗及SO2耐受性試驗，最終獲得12株酒精耐受能力大于16%，SO2耐受能力大于200 mg/L的菌株。這12株酵母初步符合生產要求。

2.2 初篩菌株的鑒定

2.3.1 WL培養基初步分類鑒定

12株酵母在WL培養基上的菌落形態如表1。從菌株在WL培養基上的形態可以初步判斷Y5，Y34，Y35，Y36，Y44，Y49，Y50 這 7 株酵母類似于釀酒酵母，其余基本可確定為非釀酒酵母。

表112株酵母在WL培養基上的菌落特征(25℃，2天)

2.2.226S rDNA D1/D2區域特異性序列分析法鑒定

以玻璃珠破壁法提取酵母的基因組DNA，以NL1/NL4為引物擴增酵母26S rDNA的D1/D2區域，擴增出的片段長度大約為600bp。將PCR擴增產物送交生工生物(上海)有限公司測序，所得序列利用BLAST比對，根據同源性大小將12株酵母進行鑒定，鑒定結果如表2，分子生物學的鑒定結果與文獻中WL培養基方法鑒定的結果基本相符[6］。

表212株酵母的鑒定結果

2.3 實驗室發酵試驗

根據鑒定結果選取其中7株釀酒酵母作為出發菌株，采用模擬葡萄醪進行發酵試驗(一)，將總的CO2失重量作為菌株的發酵力，CO2的失重速率作為菌株的發酵速率，如圖1。從圖1中可以看出，菌株Y35、Y36的發酵力、發酵速率明顯低于對照菌株“釀”，且其殘糖量較高，測的值分別為20.89 g/L，23.42 g/L，不符合生產菌株的要求，因此將這2株酵母篩除。

圖1 Y5等酵母的發酵速率

以上述5株酵母為出發菌株，并以酒廠提供的編號為“釀”、“農”的2株酵母作為對照，采用酒廠保存的葡萄汁進行發酵試驗(二)，其發酵力和發酵速率如圖2，從圖中可以看出Y44在此條件下發酵速率明顯下降，發酵不完全，因此此株酵母不能夠應用于生產。而其余幾株酵母雖在起酵時間方面有所差異，但都表現出了與生產菌株相似的發酵力及發酵速率，因此符合生產菌株的基本要求。

2.4 小型葡萄酒發酵試驗

圖2 Y5等酵母的發酵速率

通過以上的耐受性試驗及發酵試驗最終篩得4株野生酵母菌株，這些菌株均滿足生產所需的基本條件，但一株酵母的好壞僅依靠上述標準進行評判還遠遠不夠，因此我們在葡萄酒企業進行了小規模的發酵試驗，使其盡可能的接近于實際生產，監控理化指標的同時，重點對葡萄酒的風味進行分析，分析時采用了感官品評和儀器分析相結合的方法，最終實現對所篩酵母的評價。

6株試驗酵母發酵所得的紅葡萄酒的理化指標如表3，從表中數據可以看出這4株篩選酵母在規定的時間內均能將糖利用完，所釀葡萄酒的殘糖、酒精度、酸等均能達到正常的要求，從理化指標看這4株酵母滿足生產所需。

對6個酒樣進行感官品評，品評分為專家組和普通消費者組，每組3人共計6人。專家組從外觀及顏色、香氣、味道、平衡感、持續性、后味、整體評價共7方面進行了感官品評[12］，如圖7，總分為20分，消費者組主要根據自己的喜好對酒進行排序 ，其結果如表4，表5。根據表中的信息得知:篩得的4株酵母無明顯缺陷，滿足正常生產所需;在篩得的4株菌株中Y5、Y34要稍遜于 Y49、Y50，且 Y5最差，Y50最好;與企業提供的兩株酵母相比，與編號為“釀”的酒體比較相似，與編號為“農”的差別較大。

利用氣-質聯用儀對這6種酒樣進行了風味分析，總共檢測了37種風味物質，其中醇類15種、酯類13種、酸類2種、醛類2種、其它5種，6個酒樣中各種風味成分的檢測結果如表6。從表6中可以看出，2-甲基丙醇和2-甲基丁醇含量極高且水平相近，根據文獻可知這兩種屬于葡萄漿果的香氣成分[13］，因此可以推斷它們與酵母菌種的關系不大，因此接下來的分析均不考慮這兩種物質。除此之外所有樣品中含量在前10位的物質的組成相似，主要有己酸乙酯、辛酸、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、丁酸乙酯、苯乙醇、己醇、苯甲醇等。不同酒樣中物質稍有區別，其中1、2、3、6 相同，4、5 相同，區別主要在癸酸乙酯和丁二酸二乙酯上。在1、2、3、6中，樣品1和2中風味物質含量的大小順序相同，3、6與其稍有差別，4和5的排序也是稍有差別的，這與感官品評結果相呼應。在所有的香氣物質中醇類的含量最高，酒樣1-6號中其百分含量分別為67.30%、66.51%、65.74%、69.24%、68.46%、59.61%，酯類物質的含量次之，酒樣1-6號中其百分含量分別為21.69%、23.81%、21.25%、22.92%、23.38%、29.16%，酸類物質的百分含量為10.85%、9.53%、12.87%、7.72%、8.03%、11.10%，其余成分很少。感官品評表明對照菌株“農”所釀的6號酒樣表現最佳，而儀器分析的數據表明其醇類、酯類、酸類物質含量較均衡，酯類百分含量是所有酒樣中最高的，因此我們可以推斷各類物質的平衡及酯類的百分含量對酒的風味有重要的影響。Y50所釀的4號酒樣表現也較好，它的酯類含量也較高，特別是乙酸異戊酯(1.864 mg/L)、乙酸苯乙酯(0.789 mg/L)等物質的含量均明顯高于其他酒樣，這說明這幾種物質對葡萄酒的風味有重要的影響。Y5所釀的1號酒樣的感官品評最差，通過數據分析發現，它除辛酸、乙酸異戊酯及癸酸乙酯外其余的重要香氣成分含量均不高。最終我們對這4株酵母性能的綜合評價如下:

Y5:能夠在規定的時間內完成發酵，所釀葡萄酒的理化指標均正常，感官品評稍有缺陷，風味的檢測分析表明其產生辛酸、乙酸異戊酯、癸酸乙酯的能力較好，但酒與對照相比無明顯特色，不適合生產應用;

圖5 感官品評項及其所占比例

Y34:能夠在規定的時間內完成發酵，所釀葡萄酒的理化指標均正常，感官品評稍有缺陷，風味的檢測分析表明其產生己酸乙酯、癸酸乙酯的能力較好，所釀酒樣與Y5相似，不適合生產應用;

Y49:能夠在規定的時間內完成發酵，所釀葡萄酒的理化指標均正常，感官品評總體較好，風味的檢測分析表明其產生苯乙醇、辛酸、乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、丁二酸二乙酯的能力較好，具有應用于生產的潛力;

Y50:能夠在規定的時間內完成發酵，所釀葡萄酒的理化指標均正常，感官品評較好，總體優于Y5和Y34，風味的檢測分析表明其產生苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、己醇等的的能力較好，具有應用于生產的潛力。

表3 Y5等菌株所釀葡萄酒的理化指標

表4 專家組感官品評結果

表5 消費者組感官品評結果

表6 不同酒樣中各種風味成分的檢測結果 μg/L

續表6

3 結論

本文通過廣泛的收集葡萄原料分離初篩所用的酵母菌株，通過一系列的試驗對酵母進行初篩。用初篩酵母進行釀酒試驗，以理化分析、感官品評及儀器分析相結合的方法分析各個酒樣，最終我們獲得了對所篩酵母性能的綜合評價，并得出以下結論:1)原料中有著豐富的酵母資源，但是大多數的酵母為非釀酒酵母不能完成發酵;2)篩選優良酵母菌株時發酵性能是最重要、最基本的標準，但絕對不能作為唯一的標準;3)各類風味物質的平衡及酯類物質的百分含量是影響酒類整體風味的重要因素之一。通過上述方法我們獲得2株表現較好的菌株，它們均具有應用于生產的潛能。本研究還具有另外一個重要的意義，即通過本次研究建立了一套比較完整的、適用于企業的野生酵母篩選、評價的方法體系，可以為今后相關酵母菌種的選育工作提供參考。

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ABSTRACT4 different Grape samples from Changli，Hebei were adopted as wild yeast separation sources and 58 yeast strains were obtained through specific culture medium.Tests of alcohol torlerance，SO2torlerance and simulation fermentation were conducted.4 yeast strains were selected according to several criterions including fermentation capacity，fermentation rate and the ability of using sugar etc.Finally，small size wine fermentation with these yeasts was proceeded in winery.Physical and chemical analysis，sensory evaluation combined with aroma analysis through GCMS were conducted for these wine samples.Yeasts performance evaluation was done and showed that two yeasts among these four possessed the potentiality for practical production.

Key wordsWild yeast，fermentation test，sensory evaluation，GC-MS

The Screening and Performance Evaluation of Quality Wild Wine Yeast

Chen Jin-li1，Guo Yang1，Xue Jie1，Zheng Jun2，Zhao Cai-yan1
1(China National Research Institute of Food ＆ Fermentation Industries，Beijing 100027，China)
2(COFCO Huaxia Great Wall Wine Co.Ltd.，Changli 066600，China)

碩士研究生(郭陽為通訊作者)。

*國家科技支撐計劃項目(2012BAK17B11);中輕集團科技基金項目

2012-01-05，改回日期:2012-02-13