結核分枝桿菌復合群檢測在AIDS合并結核病診斷中的應用

楊紹敏，樊移山，李惠琴，高 麗，楊壁琿，張 米，李正倫，周曾全

(云南省傳染病專科醫院艾滋病關愛中心檢驗科，云南 昆明 650301)

獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)合并結核病時由于免疫缺陷導致常規抗酸染色陽性率低[1-2]、結核菌素試驗無反應[3]、臨床結核中毒表現不典型[4-5]、結核分枝桿菌培養時間較長。臨床診療迫切需要實驗室提供早期、特異的病原學診斷信息。我們探討了結核分枝桿菌轉錄酶主導基因擴增法(TMA)直接擴增結核分枝桿菌復合群(MTD)RNA在AIDS合并結核病患者實驗診斷的臨床應用。

材料和方法

一、研究對象

具有以下入組標準1條以上癥狀者即可入組。(1)持續發熱在38℃左右超過2周者;(2)頻繁咳嗽或陣發性咳嗽、咳痰超過3周者;(3)咳血或伴有血痰者;(4)有盜汗者;(5)有咽痛、胸痛超過2周者;(6)胸腔積液，胸部X線檢查異常者;(7)頭痛伴或不伴嘔吐、意識障礙者;(8)淋巴結明顯紅、腫、痛并持續發熱超過2周者;(9)胸、腹水原因不明并持續發熱超過2周者。2009年7月至2010年6月共入組152例疑似結核病待診患者。其中AIDS患者127例，男84例，女43例，年齡8～74歲。由云南省艾滋病關愛中心艾滋病確證實驗室采用免疫印跡法(WB)確證。對照組25例，男18例，女7例，年齡18～77歲，為同期內科住院和門診非人類免疫缺陷病毒(HIV)感染但臨床疑似結核病待診患者。

二、樣本種類

經培訓的醫護人員規范采集臨床樣本[6]，AIDS組127例樣本均為痰液，對照組25例樣本中有3例灌洗液、3例術后痰、1例支氣管刷落物。

三、儀器和試劑

1.美國GEN-PROBE LEADER 50i化學發光檢測儀;水浴超聲震蕩儀;95、60和42℃干浴孵育器;MTD檢測試劑盒(Amplified MTD)。

2.法國梅里埃公司的BacT/ALERT 3D 360全自動培養儀，結核菌培養溫度設置為(35±1)℃，時間設定為42 d。配套的BacT/ALERT MP結核分枝桿菌培養瓶和復溶液[6]。

3.達安基因公司DA 7600聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀及配套TB-DNA PCR試驗盒。

四、方法

1.樣本處理 痰樣本用 N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉(NALC-NaOH)進行前處理[6-7]。處理后的樣本分為3份，在沉淀物中加入1～2 mL牛白蛋白溶液混勻，取50 μL裂解液于裂解試管中，加入經前消化處理的樣本450 μL，混勻后置于水浴超聲震蕩器中15～20 min裂解細菌釋放rRNA用于MTD檢測，同樣方法裂解陽性、陰性質控物;取1 mL加入3D結核瓶進行結核分枝桿菌培養，儀器報陽即進行涂片萋-尼抗酸染色鏡檢及TB-DNA PCR 檢測[1，6];前處理的樣本最后進行涂片萋-尼抗酸染色鏡檢。支氣管灌洗物等樣本置于50 mL離心管，1200×g離心15 min，棄上清，沉淀物加入pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)0.9 mL，同樣方法處理。

2.MTD檢測 該法采用特有的等溫酶通過DNA中間體直接擴增rRNA靶基因，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。取樣本裂解產物、陽性和陰性質控物各25 μL分別加入預置有擴增試劑50 μL及甘油200 μL的擴增管內，95℃干浴15 min、42℃ 5 min，加入25 μL等溫酶試劑混勻后繼續擴增30 min，加入100 μL雜交試劑混勻，60℃雜交15 min;加入300 μL篩選試劑混勻60℃15 min，取出置室溫 5 min后，在 1 h內用LEADER 50i化學發光檢測儀檢測樣本相對發光值(relative light units，RLUs)，樣本被檢測的同時rRNA也被淬滅。結果判斷:RLUs≥500000陽性，RLUs＜30000陰性，30000～499999 RLUs可能為MTD，重復試驗以驗證結果(重復試驗RLUs≥30000即可判為陽性)。要求同批檢測的陽性質控RLUs≥1000000，陰性質控RLUs＜20000時實驗成立[8-11]。

五、統計學方法

用SPSS PASW 17.0統計軟件中，分別采用配對χ2檢驗和Fisher確切概率法對各組陽性檢出率進行統計學分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、臨床特征

AIDS組患者臨床表現咳嗽81.9%(104/127)，發熱 81.1%(103/127)，咳痰 47.2%(60/127)，消瘦 37.8%(48/127)，呼吸困難18.9%(24/127)，頭痛 6.3%(8/127)，胸痛4.7%(6/127)，血痰、皮疹、淋巴結腫痛各占3.9%(各 5/127)。發熱咳嗽的103例患者中鵝口瘡18例(14.2%)，合并肺孢子菌肺炎(PCP)9例(7.1%)，合并隱球菌感染1 例(0.8%)。

對照組患者咳痰、咳嗽各占88.0%(22/25)，發熱。消瘦各占32.0%(8/25)，血痰16.0%(4/25)，胸痛 12.0%(3/25)，呼吸困難 8.0%(2/25)。

二、MTD的符合率

127例AIDS患者中有32例結核分枝桿菌培養陽性且PCR鑒定為結核分枝桿菌，MTD均為陽性;25例對照者中有11例結核分枝桿菌培養陽性且PCR鑒定為結核分枝桿菌，MTD均為陽性，符合率為100.0%(43/43)。

三、3種方法陽性率比較

對MTD、結核分枝桿菌培養和抗酸染色3種方法對AIDS組、對照組的臨床樣本檢出陽性率進行比較，差異均無統計學意義=3.670，P ＞0.05=0.113，P ＞0.05)。對 2 組不同方法進行比較，MTD、結核分枝桿菌培養檢出率在AIDS和對照組之間差異無統計學意義;與抗酸染色陽性率差異有統計學意義(χ2=5.357，P＜0.05)，在AIDS組抗酸染色陽性率最低，見表1。

表1 AIDS組與對照組3種方法陽性檢出率比較 [例(%)]

四、其他病原菌檢出情況

127例AIDS患者在進行結核分枝桿菌培養過程中培養出其他細菌，經鑒定為非結核分枝桿菌占 9.5%(12/127)、馬尼菲青霉 1.6%(2/127)、馬紅球菌1.6%(2/127)、隱球菌 0.8%(1/127)，25例對照者中未檢出非結核分枝桿菌和真菌。

討 論

結核分枝桿菌是AIDS最常見的機會性感染，也是致死的主要原因[3]。免疫缺陷致使結核分枝桿菌雙重感染的臨床表現呈多系統播散和多個臟器病變，其癥狀、體征和影像學的表現復雜而不典型，結核病的發熱、盜汗、消瘦、乏力、咳嗽等癥狀也常被AIDS合并其他機會性感染所掩蓋，失去了結核病原有的癥狀特征和診斷意義[6，12]。因此，病原學的診斷對臨床診療非常重要。本研究結果顯示127例AIDS患者中經培養鑒定僅有25.2%(32/127)為 AIDS合并結核分枝桿菌感染。而合并鵝口瘡者占14.2%(18/127)、PCP 7.1%(9/127)，合并隱球菌感染 0.8%(1/127)，非結核分枝桿菌感染9.5%(12/127)、馬尼菲青霉感染 1.6%(2/127)。

MTD是采用等溫酶法擴增MTD rRNA，然后用一個吖啶酯標記的核酸探針與之雜交，再經雜交保護分析法篩選，最后以化學發光儀檢測被標記的rRNA[8-11]。由于同一條細菌rRNA片段的含量是DNA片段的數百至數千倍，故同一樣本擴增rRNA的敏感性將大大增加，尤其對于含菌量較少的樣本，MTD法能充分顯示出其敏感性高的優點。O'Sullivan等[11]報道了 1998年 2月至2001年10月，采用MTD方法檢測呼吸道樣本391份、非呼吸道樣本164份的結果，與結核診斷的“金標準”培養方法比較，敏感性及特異性分別為91.2%和93.9%。國外加拿大公共衛生中心采用MTD診斷結核性腦膜炎，敏感性及特異性為93.8% 及99.3%。國內重慶胸科醫院采用MTD診斷結核病的敏感性為50.7%(34/67)，特異性為96.9%(32/33)，與廣州胸科醫院的結果相同[13]。但都是用于普通結核病的診斷，目前尚無AIDS合并結核分枝桿菌診斷的報道。

由于rRNA僅存在于活的生物體內，故MTD陽性具有結核分枝桿菌活菌診斷價值。由于rRNA為單鏈結構，脆弱易降解，故不易造成環境污染。相比之下DNA為雙鏈結構，穩定、不易降解，故容易造成環境污染及假陽性結果。

本組研究中同時采用3種方法，對AIDS合并疑似結核分枝桿菌感染和非HIV感染的單純結核待診患者進行檢測，單純結核對照組進行結核分枝桿菌檢測的陽性率基本一致，而AIDS組的陽性檢出率相差較大，抗酸染色陽性率明顯低于對照組，符合AIDS患者免疫缺陷導致抗酸染色陽性率偏低的特征[1]。Karstaedt等[14]1998 年報道，經培養確診的421例成人肺結核患者中，HIV陰性的227例其涂陽率為79.0%，而HIV陽性的185例其涂陽率只有68.0%，2組差異有統計學意義。痰檢陽性率降低的原因可能與被吞噬于巨細胞內的結核分枝桿菌抗酸性減弱或消失，致使常規抗酸染色不易檢出有關。HIV感染者如懷疑合并結核病，痰、組織液或分泌物中找不到結核分枝桿菌，需做結核分枝桿菌培養或MTD檢測以明確診斷。

結核分枝桿菌培養由于AIDS患者合并細菌、真菌等機會性感染易導致假陽性，并且培養時間相對較長;而采用MTD可以彌補培養法和抗酸染色法的缺陷，陽性檢出率較高。

AIDS組抗酸染色的陽性率不僅低于培養法和MTD，而且單純涂片抗酸染色不能區分結核分枝桿菌、非結核分枝桿菌和馬紅球菌。本組資料中有2例是馬紅球菌感染，而馬紅球菌抗酸染色呈弱陽性，若是菌含量高，在抗酸染色中依然可以報告4+、3+、2+、1+等結果。而這種情況我們只有結合TB-DNA PCR、MTD及細菌鑒定才可以排除結核分枝桿菌或非結核分枝桿菌的感染。

需要注意的是，在AIDS組有很大一部分是非結核分枝桿菌感染[9.5%(12/127)]。由本研究也可以看出，在AIDS患者中出現發熱、咳嗽、咳痰等結核病癥狀時，并不能排除非結核病的可能，而是應該將非結核感染納入考慮之一。

本組資料表明，同時采用3種方法對AIDS合并結核病的病原學診斷提供了早期、特異的試驗數據，為臨床明確診斷、確定抗結核治療方案提供了及時有效的信息。由于MTD只能檢出活菌，為了排除樣本采集之后保存不當、非結核分枝桿菌感染或其他抑制物會導致的假陰性或假陽性結果，建議與培養、涂片進行平行檢測。

MTD是一種快速、敏感而特異的診斷結核病新的分子生物學檢測方法[15]，雖然MTD試劑價格較高，但可在1個工作日內得到特異的病原學診斷，為明確治療方案有著非常重要的應用價值。通過早診斷、早治療、規律、聯合全程抗結核治療，可降低醫療費用，節省整體治療和防治計劃的成本。明確的病原學診斷對有效的抗結核治療、降低AIDS合并結核病患者的死亡率都將產生積極的作用。

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