紅皮云杉多酚的提取及其抗氧化活性研究

李德海，王振宇，2，*，周亞嫌

（1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業大學食品與工程學院，黑龍江哈爾濱150090）

紅皮云杉多酚的提取及其抗氧化活性研究

李德海1，王振宇1，2，*，周亞嫌1

（1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業大學食品與工程學院，黑龍江哈爾濱150090）

以紅皮云杉球果為原料，采用溶劑浸提法，通過單因素實驗及正交實驗，研究了料液比、乙醇濃度、提取溫度及提取時間對紅皮云杉球果多酚類化合物提取的影響，并考察了紅皮云杉球果多酚的總抗氧化性、清除羥基自由基的能力、清除超氧陰離子的能力以及清除DPPH·的能力。結果表明，紅皮云杉球果多酚的最佳提取工藝條件為：液料比25∶1，乙醇濃度60%，提取溫度60℃，提取時間3h，紅皮云杉球果多酚提取量為136.3mg/g。在此條件下提取的紅皮云杉球果多酚，對于ABTS+·、OH·、DPPH·和O2-·都具有較好的清除作用，且均強于VC和BHA。

紅皮云杉，多酚，提取，抗氧化活性

Abstract：The paper utilized solvent to extract polyphenols from Picea Koraiensis Nakai pinecone.The effect of ratio of material to liquid，alcohol concentration，extraction temperature and extraction time on the polyphenol yield was researched by single factor experiment and orthogonal test.At the same time，the ability of total antioxidition，the ability to eliminating OH·，DPPH·and O2-· were investigated.The result showed that the optimum extraction condition of polyphenols was as the following：the ration of liquid to material was 25∶1，alcohol concentration was 60%，the extraction temperature was 60℃，the extraction time was 3h，the yield of polyphenols extraction from Picea Koraiensis Nakai pinecone was 136.3mg/g.The polyphenol extraction from Picea Koraiensis Nakai pinecone had good eliminating effect on ABTS+·，OH·，DPPH·and O2-·，that was better than VCand BHA.

Key words：Picea Koraiensis Nakai；polyphenol；extraction；antioxidition

近年來，國內外對于植物多酚類化合物的研究非常多，植物多酚具有較強的抗氧化、抑菌、抗癌、抗衰老和抑制膽固醇上升等活性，適量攝入植物多酚能夠有效地預防某些疾病[1]。研究表明，松科（Pinaceae）植物的球果、樹皮及種子殼中含有大量的多酚類化合物，具有優良的抗氧化[2]、抗病毒及抗菌等生物活性[3-4]。因此，松多酚成為研究學者研究開發的熱點。紅皮云杉（Picea koraiensis）是重要的松科植物，屬于常綠喬木，適應性較強，生長速度快，主要分布于我國東北大、小興安嶺，吉林長白山區等地，為我國云杉屬中分布較廣的樹種之一[5]。目前，對紅皮云杉球果中多酚類成分提取及其抗氧化活性的研究尚未見報道。本文利用溶劑法對紅皮云杉球果中的多酚進行了提取，并優化了提取工藝參數，同時利用ABTS試劑盒、水楊酸體系、1，1-二苯基-2-苦苯肼（DPPH）體系及鄰苯三酚體系測定紅皮云杉多酚的抗氧化活性，為開發具有防御自由基相關疾病的天然抗氧化劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅皮云杉球果 采集于伊春地區，常溫下干燥后粉碎，過60目篩，備用；Folin-酚試劑，沒食子酸，碳酸鈉，1，1-二苯基-2-苦味酰基苯肼（DPPH），總抗氧化活性試劑盒（ABTS），抗壞血酸（VC），丁基羥基茴香醚（BHA），鄰二氮菲，硫酸亞鐵，PBS緩沖液，雙氧水，無水乙醇。

紫外可見分光光度計TU-1800 北京普析通用儀器有限責任公司；高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器公司；R-205B旋轉蒸發儀 上海申勝儀器公司；電子天平，恒溫水浴鍋 北京醫療電子儀器廠。

1.2 紅皮云杉球果中多酚類化合物的提取

采用溶劑法提取紅皮云杉球果中多酚類化合物，準確稱取2.0g紅皮云杉球果粗粉置于三角瓶中，以一定濃度乙醇溶液作為溶劑，分別按照一定的料液比、溫度、浸提時間，于4000r/min離心10min，取上清液抽濾，收集濾液即得紅皮云杉多酚提取液。取紅皮云杉多酚提取液并適當稀釋，用Folin-Ciocalteu比色法測定多酚提取量。

1.3 正交實驗

選用乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間等4個因素做單因素實驗，確定各因素的適合范圍。在單因素實驗基礎上，采用正交實驗設計模型，選用乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間4個因素為自變量，以紅皮云杉球果多酚提取量為考察指標，設計三因素三水平L9（34）正交實驗，分析因素與水平設計實驗因素與水平編碼表見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

1.4 紅皮云杉球多酚提取量的測定

1.4.1 標準曲線的繪制 采用Folin-Ciocalteu比色法[6]測定紅皮云杉球多酚提取量，準確吸取100mg/L的沒食子酸標準溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL置于10mL容量瓶內，分別加入Folin-酚試劑1mL，充分振蕩后加入1mol/L Na2CO3溶液5mL，搖勻后50℃水浴5min，冷卻后于760nm下測定吸光度。以沒食子酸總酚含量為X軸，以吸光度為Y軸。以含量對吸光度進行直線回歸，得標準曲線方程方程：Y=0.1493X-0.0010，R2=0.9988。

1.4.2 紅皮云杉多酚提取量的測定 取1mL稀釋后的球果多酚提取液，加入Folin-酚試劑1mL，充分振蕩后加入1mol/L Na2CO3溶液5mL，搖勻后50℃水浴5min，冷卻后于760nm下測定吸光度。將吸光度帶入標準曲線方程計算樣品中多酚類化合物的提取量。

1.5 紅皮云杉多酚抗氧化活性研究

1.5.1 總抗氧化活性的測定 采用ABTS法測定紅皮云杉多酚的總抗氧化活性，分別將提取物配制成一系列濃度的溶液。在96孔板中加依次入20μL過氧化物酶液，10μL待測液，170μL ABTS工作液，搖勻，溫育6min，在405nm波長處測定其吸光度。以溶劑乙醇代替待測液作空白對照，測定吸光度，按下式計算：

式中：A1為加入待測液的吸光度，A為空白對照的吸光度。以VC、BHA溶液作為對照。

1.5.2 清除羥自由基（·OH）能力測定 參照文獻[7]的方法稍作修改，分別將提取物配制成一系列濃度的溶液。在試管中依次加入6mmol/L的FeSO4溶液1mL、6mmol/L的H2O2溶液1mL和待測溶液1mL，搖勻，靜置10min，再加入6mmol/L的水楊酸溶液1mL，搖勻，靜置30min后于510nm波長處測其吸光度。以乙醇溶液代替待測液作空白對照，測定吸光度。以VC、BHA溶液代替樣品作為陽性對照。按下式計算清除率：

式中：A為空白對照的吸光度；A0為無水楊酸時加入待測液的吸光度；A1為加入待測液的吸光度。

1.5.3 清除DPPH自由基能力測定 參照文獻[8]的方法稍作修改，分別將提取物配制成一系列濃度的溶液，在試管中加入2mL 1×10-4mol/L的DPPH·溶液（用無水乙醇配制），之后再加入1mL待測液，搖勻，避光反應30min后于517nm處測定吸光值，以2.0mL無水乙醇與1.0mL待測液作參比，測定吸光值，同時以1mL溶劑乙醇溶液和2mL DPPH·溶液作為空白對照測定吸光度值。以VC、BHA溶液代替樣品作為陽性對照。清除率計算公式：

式中：A1為加入待測液的吸光度；A0為無DPPH·加入時的吸光度；A為空白對照的吸光度。

1.5.4 清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力的測定參照文獻方法[9]稍作修改，分別將提取物配制成一系列濃度的溶液。取pH8.2的Tris-HCl緩沖液4.5mL于試管中，25℃水浴中保溫10min，加入不同濃度待測液1mL，混勻后加入1mL在37℃水浴中預熱的鄰苯三酚（用10mmol/L鹽酸配制），在37℃水浴中準確反應10min，立即用6mol/L鹽酸3滴終止反應，在320nm下測其吸光度。以乙醇溶液代替待測液作為空白對照，測定吸光度。以10mmol/L HCl代替鄰苯三酚溶液作為參比，測定吸光度。以VC、BHA溶液代替樣品作為陽性對照。清除率公式：

式中：A為空白對照的吸光度；A1為加入待測液的吸光度；A0為無鄰苯三酚加入時的吸光度。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗及其分析

2.1.1 液料比對多酚提取量的影響 以60%的乙醇溶液作為溶劑，分別按照料液比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（g/mL），50℃水浴浸提60min，然后4000r/min離心10min后取上清液抽濾，定容并稀釋，考察液料比對紅皮云杉多酚提取量的影響，實驗結果如圖1所示。

圖1 液料比對多酚提取量的影響Fig.1 Effect of ratio of liquid to material on polyphenols yield

從圖1中可以看出，紅皮云杉多酚提取量隨著料液比的增大而提高，其中液料比從5∶1變化到25∶1時，多酚提取量的提高最為明顯，而料液比在25∶1～35∶1的變化中，多酚提取量的上升趨勢明顯減弱，因此綜合經濟因素考慮，確定最佳液料比為25∶1。

2.1.2 乙醇濃度對多酚提取量的影響 分別用0、20%、40%、50%、60%、70%、80%、100%的乙醇溶液，按照25∶1液料比，50℃水浴浸提60min，然后4000r/min離心10min后取上清液抽濾，定容并稀釋，考察乙醇濃度對紅皮云杉多酚提取量的影響，實驗結果如圖2所示。

圖2 乙醇濃度對多酚提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on polyphenols yield

從圖2中可以看出，乙醇濃度為50%時，多酚的提取量最大，乙醇濃度大于或者小于50%都會導致多酚提取量下降。可能因為部分多酚屬于水溶性物質，所以溶劑濃度偏大或者偏小都會影響總酚提取量。根據這一實驗結果，可確定最佳提取溶劑濃度為50%。

2.1.3 提取溫度對多酚提取量的影響 以50%的乙醇溶液作為溶劑，按照液料比25∶1，分別在30、40、50、60、70、80、90℃下水浴浸提60min，然后4000r/min離心10min后取上清液抽濾，定容并稀釋。取適量稀釋后的提取液，考察提取溫度對紅皮云杉多酚提取量的影響，實驗結果如圖3所示。

圖3 提取溫度對多酚提取量的影響Fig.3 Effect of extract temperature on polyphenols yield

從圖3中可以看出，提取溫度在30～50℃范圍內，多酚提取量處于上升趨勢，這是由于溫度越高，分子運動越強烈，多酚類物質更容易溶出。但在提取溫度高于50℃的范圍里，多酚提取量呈下降趨勢，這可能是由于過高的溫度會導致多酚類物質分解而造成，因此，可以確定最佳的提取溫度為50℃。

2.1.4 提取時間對多酚提取量的影響 以50%的乙醇溶液作為溶劑，按照液料比25∶1，在50℃溫度下，分別反應1、2、3、4、5、6h，然后4000r/min離心10min后取上清液抽濾，定容并稀釋，考察提取時間對紅皮云杉多酚提取量的影響，實驗結果如圖4所示。

圖4 提取時間對多酚提取量的影響Fig.4 Effect of extract time on polyphenols yield

從圖4中可以看出，提取時間在240min內，隨著時間的增加，多酚提取量也有所提高，這可能是因為在一定的時間范圍內，時間越長，多酚類物質溶出得越多。但當提取時間超過240min，多酚提取量基本持平，這可能是由于其他因素的限制，導致多酚無法再更多地溶出。

2.2 正交實驗結果

對紅皮云杉球果多酚提取條件進行優化，實驗結果如表2所示。

表2 正交實驗結果及極差分析表Table 2 The results and range analysis of the orthogonal test

從表2實驗結果可以看出，A3B2C3D1為最佳工藝參數，在此條件下，最佳工藝參數為乙醇濃度為60%、液料比為25∶1、提取溫度為60℃、提取時間為3h。根據對紅皮云杉球果多酚提取量（RB＞RA＞RC＞RD）的極差分析，乙醇濃度是影響紅皮云杉球果多酚提取量的第一因素，液料比為為第二因素，而提取時間和提取溫度對紅皮云杉球果多酚提取量的影響較小。

在此條件下，進行驗證實驗，結果紅皮云杉球果多酚提取量為136.3mg/g，均高于表2中的其他組合，說明此工藝可行。

2.3 總抗氧化活性分析

本實驗以天然抗氧化劑VC和人工合成的抗氧化劑BHA作為對照，評價紅皮云杉球果多酚的總抗氧化活性，實驗結果見圖5。

圖5 紅皮云杉球果多酚、VC及BHA對ABTS+·的清除作用Fig.5 The ABTS+·scavenging activity of polyphenols，VCand BHA

從圖5中可以看出，VC、BHA和紅皮云杉球果多酚對ABTS+·都有清除作用，其中紅皮云杉球果多酚和VC隨著濃度的增加，對ABTS+·清除率顯著增加，表明紅皮云杉球果多酚和VC對ABTS+·清除效果非常明顯，而BHA隨著濃度的增加，對ABTS+·清除率增加不顯著，而且其對ABTS+·清除率也比較低，表明BHA對ABTS+·清除效果不明顯。綜合對比表明，紅皮云杉球果多酚對ABTS+·有較好的清除作用。

2.4 清除羥自由基（·OH）能力

本實驗以天然抗氧化劑VC和人工合成的抗氧化劑BHA作為對照，評價紅皮云杉球果多酚清除羥自由基（·OH）的能力，實驗結果見圖6。

圖6 紅皮云杉球果多酚、VC及BHA對OH·的清除作用Fig.6 The OH·scavenging activity of polyphenols，VCand BHA

從圖6中可以看出，紅皮云杉球果多酚和VC對·OH都有較明顯的清除作用，紅皮云杉球果多酚和VC隨著濃度的增加，對·OH清除率顯著增加，表明紅皮云杉球果多酚和VC對·OH清除效果非常明顯，從圖6中還可以看出，紅皮云杉球果多酚對·OH清除率明顯高于VC。BHA對·OH的清除率很低，而且清除率幾乎不隨濃度的變化而改變。綜合對比表明，紅皮云杉球果多酚對·OH有較好的清除作用。

2.5 清除DPPH·能力

本實驗以天然抗氧化劑VC和人工合成的抗氧化劑BHA作為對照，評價紅皮云杉球果多酚清除DPPH·的能力，實驗結果見圖7。

從圖7中可以看出，VC、BHA和紅皮云杉球果多酚對DPPH·都有清除作用，其中紅皮云杉球果多酚和VC隨著濃度的增加，對DPPH·清除率有一定程度增加，表明紅皮云杉球果多酚和VC對DPPH·清除效果明顯，而BHA隨著濃度的增加，對DPPH·清除率幾乎不增加，而且對DPPH·清除率也比較低，表明BHA對DPPH·清除效果不明顯。綜合對比表明，紅皮云杉球果多酚對DPPH·有較好的清除作用。

圖7 紅皮云杉球果多酚、VC及BHA對DPPH·的清除作用Fig.7 The DPPH·scavenging activity of polyphenols，VCand BHA

2.6 清除超氧陰離子自由基作用

本實驗以天然抗氧化劑VC和人工合成的抗氧化劑BHA作為對照，評價紅皮云杉球果多酚清除超氧陰離子的能力，實驗結果見圖8。

圖8 紅皮云杉球果多酚、VC及BHA對O2-·的清除作用Fig.8 The O2-·scavenging activity of polyphenols，VCand BHA

從圖8可以看出，VC、BHA和紅皮云杉球果多酚都能有效清除超氧陰離子自由基，其中紅皮云杉球果提取物即松多酚的清除率最高，其次是VC，最后是BHA，且紅皮云杉球果提取物和VC隨濃度的上升提取量都有較為明顯的增加，而BHA的清除率隨濃度上升的變化幅度并不明顯。

3 結論

3.1 通過單因素實驗和正交實驗優化得到紅皮云杉球果中松多酚的最佳提取工藝條件為：液料比25∶1，乙醇濃度60%，提取溫度60℃，提取時間180min。在最佳工藝下，多酚提取量達到136.3mg/g球果。由此結果可以看出，對紅皮云杉球果中松多酚的研究是具有很大前景的。

3.2 根據對紅皮云杉球果中提取的松多酚的總抗氧化性、清除羥基自由基能力、清除DPPH·能力以及清除超氧陰離子自由基能力的測定，可以得知紅皮云杉球果中提取的松多酚具有較強的抗氧化性，并且在與天然抗氧化劑VC和人工合成抗氧化劑BHA的比較中，占有明顯的優勢。鑒于氧化傷害是人體多種疾病和衰老的主要源頭所在，對于紅皮云杉球果中松多酚的研究，必然會對人類健康產生巨大的積極作用，可以說紅皮云杉球果中的松多酚是一種極具潛力的天然抗氧化劑。

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Study on the extraction conditions and antioxidition of polyphenol from Picea Koraiensis Nakai

LI De-hai1，WANG Zhen-yu1，2，*，ZHOU Ya-xian1
（1.School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.School of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China）

TS201.1

B

1002-0306（2012）20-0206-05

2012-05-16 *通訊聯系人

李德海（1976-），男，博士，講師，研究方向：食品化學及植物有效成分。

國家自然科學基金資助項目（31170510）。