不同蛋白水解物在大豆油水包油乳狀液中的抗氧化作用

程 宇，陳 潔，馬海樂，熊幼翎

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

不同蛋白水解物在大豆油水包油乳狀液中的抗氧化作用

程 宇1，2，陳 潔2，馬海樂1，熊幼翎2

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

以TBARS為指標(biāo)，用烘箱加速氧化法考察了大豆蛋白水解物、乳清蛋白水解物和馬鈴薯蛋白水解物對大豆油水包油（O/W）乳狀液氧化穩(wěn)定性的影響。采用離心法分析了不同蛋白水解物在乳狀液兩相中的分布，并測定了界面上蛋白水解物的分子量分布。實驗表明，這些蛋白水解物在乳狀液中都顯示了一定的抗氧化能力。并且有一部分蛋白水解物分布在乳狀液界面上。分布在界面上的蛋白水解物可能是通過物理作用（屏蔽和靜電作用）和化學(xué)作用（清除自由基）延緩了脂肪的氧化。

乳狀液，蛋白水解物，抗氧化，界面

Abstract：Effect of soy protein hydrolysate，whey protein hydrolysate and potato protein hydrolysate on the oxidation stability of soybean oil-in-water emulsion was investigated.Lipid oxidation was estimated using 2-thiobarbituric acid reactive substances（TBARS） as indicator.Partition of these hydrolysates was determinded by centrifugation.Also，Molecular weight distribution of these hydrolysates was determined.It was indicated that these protein hydrolystes were able to retard the lipid oxidation of emulsions.A portion of protein hydrolysates was partitioning in the interace of emulsion.Both physical and chemical action of the hydrolysates distributing in the interface of emulsion played an important role in inhibiting lipid oxidation.

Key words：emulsion；protein hydralysate；antioxidant；interface

脂肪氧化是引起食品品質(zhì)劣變的主要因素之一。乳狀液作為一種重要的食品載體體系，同樣存在脂肪氧化的問題。通常，一些合成的抗氧化劑會被添加到食品中用于抑制食品中脂肪的氧化。然而近年來，隨著人們生活水平越來越好，人們開始關(guān)注一些傳統(tǒng)化學(xué)合成添加劑的安全性，因此，研究人員開始不斷尋找和開發(fā)天然來源的替代品，具有抗氧化性的蛋白水解物就是其中的一種。已經(jīng)有很多研究報道了通過酶水解得到的蛋白水解物可以有效清除自由基，表現(xiàn)出了良好的抗氧化能力[1-3]。同時，將一些蛋白水解物添加到食品體系如肉餅[4-5]和香腸[6-7]中，產(chǎn)品中的脂肪氧化得到了有效的延緩，使產(chǎn)品貨架期得到了延長。然而，將水解蛋白應(yīng)用于水包油乳狀液的研究則較少[8]。而乳狀液體系是廣泛存在于食品中的一個體系，因此有必要對水解蛋白在乳狀液中的作用進行研究。本實驗將不同來源的水解蛋白作為共乳化劑用于制備乳狀液，觀察它們對乳狀液氧化穩(wěn)定性的影響，并對這些蛋白水解物的作用進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯濃縮蛋白 荷蘭AVEBE BA，蛋白含量81%；大豆分離蛋白 哈爾濱黎明植物蛋白科技有限責(zé)任公司，蛋白含量90%；乳清蛋白 美國Davisco公司，蛋白含量90%；Alcalase 諾維信公司；Flavoruzyme 無錫酶制劑廠；1，1，3，3-四乙氧基丙烷（TEP） Sigma公司；大豆油 東海油脂（張家港）公司；其他試劑 上海國藥集團，分析純；實驗用水為超純水，自制。

pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DC10-K10加熱制冷循環(huán)器 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Avanti J-26 XP高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；冷凍干燥機 德國Marin Christ公司；T18高速乳化均質(zhì)機 德國IKA公司；AH-basic型高壓均質(zhì)機 ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司；UV-2800型紫外可見光分光光度計 尤尼柯（上海）科學(xué)儀器有限公司；Marlvern Nano ZS動態(tài)光散射儀英國馬爾文儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同蛋白水解物的制備

1.2.1.1 馬鈴薯蛋白水解物（PPH） 參考Wang[5]等人的方法。將馬鈴薯濃縮蛋白溶液（4%，w/v）調(diào)pH到8.0左右，用Alcalase在50℃水解6h，酶底比為1∶100。水解結(jié)束后，用1mol/L的NaOH調(diào)pH至7.0，80℃滅酶15min。7000×g離心后取上清液冷凍干燥。

1.2.1.2 大豆蛋白水解物（SPIf） 參考Pena-Ramos[9]等人的方法。將大豆分離蛋白（2%，w/v）在90℃預(yù)熱5min，調(diào)pH到7.0左右，用Flavoruzyme在50℃水解0.5h，酶底比為1∶100。水解結(jié)束后，用1mol/L的NaOH調(diào)pH至7.0，80℃滅酶15min。7000×g離心后取上清液冷凍干燥。

1.2.1.3 乳清水解蛋白物（WPIf） 參考Pena-Ramos[9]等人的方法。將乳清分離蛋白（2%，w/v）在90℃預(yù)熱5min，調(diào)pH到7.0左右，用Flavoruzyme在50℃水解1h，酶底比為1∶100。水解結(jié)束后，用1mol/L的NaOH調(diào)pH至7.0，80℃滅酶15min。7000×g離心水解液，取上清液冷凍干燥。

1.2.2 乳狀液的制備 水相溶液：將Tween20（1.125%，w/w）溶于10mg/mL不同蛋白水解物溶液（0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.0）。將大豆油（10%，w/w）和水相溶液（90%，w/w）用高速分散機在21500r/min下乳化2min，再將乳化液用高壓均質(zhì)機在32MPa均質(zhì)兩次，并在得到的乳狀液中加入NaN3（0.02%，w/w）作為抑菌劑。乳狀液的Zeta電位和粒徑用Malvern Nano ZS動態(tài)光散射儀測定。乳狀液的粒徑在氧化過程中沒有顯著變化。

1.2.3 乳狀液的氧化 將乳狀液分裝在20mL帶蓋的玻璃瓶中，用鋁箔紙包裹，在瓶中加入適量體積乳狀液（每瓶中液體體積相同，并保證氧氣充足），放入隔水式培養(yǎng)箱中37℃氧化。定期測定體系TBARS值。TBARS的測定方法參考Mei[10]等人的方法。以1，1，3，3-四乙氧基丙烷（TEP）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定樣品中的TBARS值。

1.2.4 蛋白水解物在乳狀液中的分布 取1mL乳狀液在Eppendorf管中，室溫下15000×g離心45min，取下層乳清層再次15000×g離心45min，然后取下清液過0.22μm濾膜，得到的濾液稀釋到一定濃度用福林酚法測定蛋白含量即得到水相中蛋白水解物的含量。蛋白水解物分布的計算參考Huang[11]等人的方法，為不同相蛋白占原始蛋白含量的比例。

1.2.5 分布在界面上蛋白水解物的分子量分布 取一定體積乳狀液在50mL離心管中，20℃下50000×g離心45min，小心取出第一次離心得到的乳化層，加入緩沖液混勻，20℃下50000×g離心45min，小心取出乳化層，加氯仿-甲醇（2∶1）混合溶劑進行萃取（蛋白水解物會進入上層甲醇相），離心，將收集得到的甲醇相中甲醇旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去，得到界面上的蛋白水解物。其分子量分布使用凝膠排阻色譜進行分析。分析使用的色譜柱為Shodex Kw802.5，流動相為50mmol/L磷酸緩沖鹽（pH7.0）+0.3mol/L NaCl，流速為0.8mL/min，柱溫25℃。分子量由標(biāo)準(zhǔn)品測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到。

1.2.6 ABTS+自由基清除能力 參考Cheng[12]等人的方法。

1.2.7 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用DPS中單因素實驗統(tǒng)計分析以及Tukey法多重比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同水解蛋白清除ABTS自由基的能力

從實驗結(jié)果（圖1）可以看到，10mg/mL的大豆蛋白水解物、乳清蛋白水解物和馬鈴薯蛋白水解物都表現(xiàn)出了較好的自由基清除能力，ABTS+自由基的清除能力都超過了60%。其中，馬鈴薯蛋白水解物表現(xiàn)出了最好的自由基清除能力，自由基清除率達到了90%以上。自由基反應(yīng)是引起乳狀液中脂肪氧化的一個重要原因，因此這幾種顯示出抗氧化活性的水解物都可以用于抑制乳狀液中脂肪的氧化。

圖1 不同蛋白水解物的ABTS+自由基清除能力Fig.1 ABTS+radical scavenging capacity of different protein hydrolysates

2.2 不同水解蛋白對乳狀液中脂肪氧化的抑制作用

從圖2可以看到和未加蛋白水解物的乳狀液相比，加入了抗氧化活性蛋白水解物的乳狀液都表現(xiàn)出了更好的氧化穩(wěn)定性。和對照樣品相比，添加大豆蛋白水解物、乳清蛋白水解物和馬鈴薯蛋白水解物的乳狀液在0d時TBARS的值低于前者（p＜0.05）。經(jīng)過10d的氧化，添加蛋白水解物的乳狀液中脂肪氧化的程度依然顯著低于未添加抗氧化劑的乳狀液（p＜0.05）。在第10d時，和對照樣品相比，添加了大豆蛋白水解物、乳清蛋白水解物和馬鈴薯蛋白水解物的乳狀液中TBARS的生成量分別降低了77.6%、77.8%和25.6%（p＜0.05）。特別是添加了大豆蛋白水解物和乳清蛋白水解物的乳狀液，經(jīng)過10d的氧化，脂肪氧化產(chǎn)物丙二醛類物質(zhì)并未有顯著的提高（p＞0.05），表現(xiàn)出了較高的氧化穩(wěn)定性。盡管馬鈴薯蛋白水解物清除自由基能力最高，但是其對乳狀液穩(wěn)定性的提高程度并不及大豆蛋白水解物和乳清蛋白水解物。這表明乳狀液氧化穩(wěn)定性的提高還和其他因素有關(guān)。

圖2 添加不同蛋白水解物的乳狀液的氧化穩(wěn)定性Fig.2 Oxidation stability of emulsion prepared with different protein hydrolysates

2.3 蛋白水解物在乳狀液中的分布

在乳狀液中，抗氧化劑在乳狀液中的分布與其抗氧化性存在一定的聯(lián)系[11]。實驗結(jié)果（圖3）表明，添加了蛋白水解物的乳狀液中，有一部分蛋白水解物分布在了乳狀液的油水界面上。其中，乳清蛋白水解物在界面上分布的比例較高，達到了27.9%；而大豆蛋白水解物在界面上分布的比例較低，只有2.8%。由于脂肪的氧化易于在界面上發(fā)生，因此改變界面上的組成則可以有效改變脂肪氧化的速率。蛋白水解物吸附在油水界面上，可以形成有效的阻隔層，起到了一定的物理屏障作用和阻斷自由基反應(yīng)的化學(xué)作用。乳狀液中脂肪顆粒屬于非連續(xù)性分布，自由基的傳遞則需要通過連續(xù)相的水來進行，而在水相中分布的蛋白水解物也可以起到很好的阻斷脂肪氧化的作用，從而延緩脂肪的氧化。

圖3 不同蛋白水解物在水相和界面上的分布以及相應(yīng)乳狀液的Zeta電位Fig.3 Partition of different protein hydrolysates in water phase and at the interface and ζ-potential of emulsions prepared with different protein hydrolysates

和陰離子乳化劑的結(jié)果不同，盡管加入蛋白水解物的乳狀液的Zeta電位為負(fù)值，這些乳狀液依然顯示了優(yōu)于對照乳狀液的氧化穩(wěn)定性。而且，添加了乳清蛋白水解物的乳狀液盡管其Zeta電位更低，但氧化穩(wěn)定性要優(yōu)于Zeta電位相對較高的添加馬鈴薯蛋白水解物乳狀液。較低的電位表明在界面上的組分有更強的親和過渡金屬離子的靜電作用，可以有效阻止這些過渡金屬離子與過氧化物接觸。同樣，雖然大豆蛋白水解物在界面上的分布較少，但是這部分蛋白水解物形成的靜電相互作用仍然較強。同時，界面上物質(zhì)對鐵離子和銅離子等油脂氧化催化劑的作用不僅有靜電作用，也可能包括其本身在界面上的空間阻礙作用。因而添加大豆蛋白的乳狀液也表現(xiàn)出了較好的氧化穩(wěn)定性。

2.4 分布在界面上的蛋白水解物的分子量分布

分子量分布測定的結(jié)果（表1）表明，分布在界面上的蛋白水解物的分子量大部分集中在400～2000u之間，因而這些小分子量段的蛋白水解物是分布在界面上的水解蛋白起主要作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。小分子量段的蛋白水解物由于分子較小，吸附速率比大分子高，在乳化的過程中有更多的幾率和乳化劑競爭吸附在脂肪表面，或是與乳化劑通過非共價鍵吸附在乳化劑表面，形成了更有效的脂肪保護層如膜的致密性可能較高。而很多研究都表明，小分子量段的蛋白水解物在化學(xué)性質(zhì)上表現(xiàn)出更好的抗氧化活性。而馬鈴薯蛋白水解物盡管分子量較大，可能有較好的空間阻礙作用，但是也正是其空間位阻作用而導(dǎo)致界面致密度下降，表現(xiàn)出了比其他蛋白水解物弱的抑制氧化作用。

表1 不同乳狀液界面上蛋白水解物的分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of protein hydrolysates partitioning in the interface of different emulsions prepared with different protein hydrolysates

3 結(jié)論

在乳狀液中添加大豆蛋白水解物、乳清蛋白水解物和馬鈴薯蛋白水解物可以有效抑制脂肪的氧化。盡管馬鈴薯蛋白水解物的清除自由基能力最強，但是大豆蛋白水解物和乳清蛋白水解物可以更好地抑制乳狀液脂肪的氧化。所有蛋白水解物制備的乳狀液中都有一部分蛋白水解物分布在乳狀液界面上。其中乳清蛋白水解物在界面上分布的量最高，達到了27.9%。分布在乳狀液界面上的蛋白水解物都有助于延緩乳狀液中脂肪的氧化。這部分蛋白水解物主要是分子量分布在400到2000u的小分子多肽。

[1]涂宗財，鄭明，陳鋼，等.酶解魚鱗蛋白制備抗氧化肽的研究[J].食品工業(yè)科技，2009，30（7）：202-206.

[2]任嬌艷，趙謀明，崔春，等.草魚源抗氧化肽的響應(yīng)面法優(yōu)化制備及活性評價[J].食品工業(yè)科技，2009，30（7）：69-73.

[3]Elias R J， Kellerby S S， Decker E A.Antioxidant activity of proteins and peptides[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2008，48（5）：430-441.

[4]Diaz M，Decker E A.Antioxidant mechanisms of caseinophosphopeptides and casein hydrolysates and theirapplication in ground beef[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（26）：8208-8213.

[5]Wang L L，Xiong，Y L.Inhibition of lipid oxidation in cooked beef patties by hydrolyzed potato protein is related to its reducing and radical scavenging ability[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53（23）：9186-9192.

[6]Nieto G，Castillo M，Xiong Y L，et al.Antioxidant and emulsifying properties of alcalase-hydrolyzed potato proteins in meat emulsions with different fat concentrations[J].Meat Science，2009，83（1）：24-30.

[7]石麗梅.玉米蛋白水解物對于中式香腸的氧化穩(wěn)定性的影響研究[D].無錫：江南大學(xué)，2008.

[8]Elias R J，Bridgewater J D，Vachet R W，et al.Antioxidant mechanisms of enzymatic hydrolysates of β-lactoglobulin in food Lipid dispersions[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（25）：9565-9572.

[9]Pena-Ramos E A，Xiong Y L.Whey and soy protein hydrolysates inhibit lipid oxidation in cooked pork patties[J].Meat Science，2006，64（3）：259-630.

[10]Mei L，McClements D J，Wu J，et al.Iron-catalyzed lipid oxidation in emulsion as affected by surfactant，pH and NaCl[J].Food Chemistry，1998，61（3）：307-312.

[11]Huang S W，F(xiàn)rankel E N，Aeschbach R，et al.Partition of selected antioxidants in corn oil-water model systems[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45（6）：1991-1994.

[12]Cheng Y，Xiong Y L，Chen J.Antioxidation and emulsifying property of hydrolyzed potato protein in soybean oil-in-water emulsions[J].Food Chemistry，2010，120（1）：101-108.

Effect of different protein hydrolysates on the antioxidant in the soybean oil-in-water emulsion

CHENG Yu1，2，CHEN Jie2，MA Hai-le1，XIONG You-ling2
（1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

TS201.2

A

1002-0306（2012）16-0108-04

2012-02-01

程宇（1981-），男，博士，講師，研究方向：食品蛋白質(zhì)功能。

國家自然科學(xué)基金項目（20976071）；973計劃前期研究專項（2010CB535014）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目（PADA）；江蘇大學(xué)高級專業(yè)人才科研啟動基金（11JDG051）。