細胞外信號調節激酶信號途徑及其與動物肌肉生長發育的關系

張 勇 李欣蔚 朱宇旌 邵彩梅

(1.沈陽農業大學畜牧獸醫學院，沈陽 110866；2.遼寧禾豐牧業股份有限公司，沈陽 110164)

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPK)信號轉導系統是細胞外信號引起核反應的細胞信息傳遞的共同途徑。MAPK是一族在細胞內廣泛分布、含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白激酶，包括細胞外信號調節激酶(extracellular signal－regulated kinases，ERK)、c－jun 氨基末端激酶(c－jun N－terminal kinases，JNK)和 p38 絲裂原激活蛋 白 激 酶 (p38 mitogen－activated protein kinases，p38)3個主要成員。它們普遍存在于多種生物中，如原核生物和哺乳動物細胞。其中ERK主要被生長因子、多肽類激素以及神經遞質激活，控制細胞增殖、分化、生存和凋亡［1－2］。其信號轉導是涉及調節細胞生長、發育及分化的信號網絡的核心，細胞內多種信號分子最終通過磷酸化ERK發揮生物學效應。

1 ERK的分子生物學特性及其信號途徑

1.1 ERK的分子生物學特性

ERK在20世紀90年代初期得到分離鑒定，ERK1、ERK2相對分子質量分別為44×103和42×103，也稱為 p44 MAPK、p42 MAPK，有 90%的同源性［3］。ERK具有MAPK家族2個顯著特征，即:1)通過區域Ⅷ絲氨酸、蘇氨酸雙位點磷酸化活化；2)是脯氨酸導向絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。

ERK1和ERK2是目前研究較多的EPK，根據美國蛋白質數據庫(protein data bank，PDB)的資料顯示，ERK1和ERK2亞型具有顯著相似的氨基酸序列，其中編碼ERK1的基因為1 759 bp，晶體結構見圖1。鼠類、原核生物以及人各個組織中的ERK序列分析結果表明，各組織中的ERK具有高度同源性，共性包括:子域1中的主要的共有基元GXGXXGXV(甘氨酸31至纈氨酸38)可以用來錨定非可移動的ATP磷酸鹽的位置；子域2中不變的賴氨酸53以及臨近區域(纈氨酸50至絲氨酸56)，它們的功能是根據ATP的最大活性來結合ATP并確定其結合方向；組氨酸144至精氨酸151的催化環；用以被激活的對偶磷酸化的保守子域(蘇氨酸178至蘇氨酸180)；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的不變殘基［4］。ERK的保守子域用以與其激活物、抑制劑以及特異性磷酸化底物進行對接，由于其位置位于靠近ERK分子的C端，與催化結構域相毗鄰，故被稱為CD子域。這段CD子域與MAPK家族中其他成員的保守子域結構相似，這解釋了MAPK家族在功能上的相似性。CD子域中含有一些保守的天冬氨酸殘基，這些殘基在與其底物的對接的過程中發揮了重要作用，人類ERK2中CD子域的氨基酸序列為:311LEQYYDPSDEPIA324，其中編碼CD子域的基因位點位于255～1 457 bp。

圖1 ERK1晶體結構Fig.1 The crystal structure of ERK1

ERK作為MAPK家族的一員，其基本的信號傳遞步驟遵循MAPK的3級酶促級聯反應，即Ras－ Raf－ MAPK 激 酶(mitogen－activated protein kinase kinase，MEK)－ERK途徑。受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)、G 蛋白偶聯受體(G protein－coupled receptor，GPCR) 和某些細胞因子受體均可激活ERK信號途徑［5］。多數信號因子對ERK的活化都始于對Ras的激活，活化的Ras可進一步與Raf的N端結合并使其激活。Raf可磷酸化激活MEK1和MEK2，進而高度選擇性活化ERK1和ERK2。G蛋白偶聯受體也可以通過一系列復雜的級聯反應影響ERK活化。此外某些細胞因子受體可通過激活雙面神激酶(Janus kinase，JAK)、磷酸化Src同源性和膠原蛋白(Shc)，進而激活ERK［6］。而負反饋調節則是保證MAPK不持續活化的重要機制，MAPK可以誘導產生3種不同的蛋白磷酸酶以抑制MAPK活化，分別為二元特異性磷酸酶、蘇氨酸磷酸酶和酪氨酸磷酸酶［7］。

除此以外，鈣離子、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)以及偽狂犬病病毒衣殼蛋白均可以影響ERK信號途徑的活性。其中，蛋白激酶C是通過不同的機制調節ERK的活性的，并且這種調節作用是具有細胞類型特異性的。而偽狂犬病病毒衣殼蛋白則是通過限制MAPK－ERK信號途徑在核膜上的靶因子活性來限制ERK信號途徑的［8］。

1.2 Ras-Raf-MEK-ERK信號途徑概述

Ras－Raf－MEK－ERK 是從細胞表面受體到轉錄因子的一組級聯轉導信號，用以調控基因的表達，途徑見圖2［9］。這些級聯的信號會調控許多細胞凋亡基因的表達。作用方式有染色體異位、細胞因子受體基因(如 Flt－3、Kit、Fms)突變以及野生型基因的過度表達或者受體突變等。Raf－MEK－ERK途徑作用于細胞凋亡基因［如 Bad、Bim、Mcl－1、半胱天冬酶9(caspase－9)以及尚有爭議的B細胞淋巴瘤2(Bcl－2)］翻譯后的磷酸化，對細胞凋亡具有深遠的影響。同時，該途徑對細胞周期的進程也存在多種方式的影響［10］。

Ras作為 Raf－MEK－ERK 途徑的上游蛋白，是最早發現的小G蛋白，為原癌基因Ras的產物，具有活化態的GTP結合構象與失活態的GDP結合構象。2種構象可以相互轉變，在信號轉導過程中發揮開關作用。

當細胞內外的各種刺激激活Ras后，Ras利用高親和力和Raf N端的2個區域(Ras結合域、半胱氨酸富集域)結合，將Raf從胞質轉移到胞膜，在胞膜上Raf絲氨酸/蘇氨酸發生磷酸化而被激活。Raf被激活后，它的C端催化區能與MEK結合，并使其催化區區域Ⅷ中2個精氨酸位點磷酸化，從而使MEK激活。MEK屬于少有的雙重特異性激酶，使酪氨酸和蘇氨酸2個調節位點磷酸化而激活ERK。

1.3 ERK信號途徑的功能特點

ERK信號途徑具有以下特點:1)活化的ERK通過轉位方式進入細胞核，激活其下游底物的表達，主要是一些編碼核轉錄因子的早期反應基因(如原癌基因 c-Fos、c-Myc、c-Jun 和 Erg－1 等)；調控細胞生長反應，導致次級反應基因(如ANF、MHC、Mlc－2等)的異常表達，影響細胞功能。2)ERK可將多個不同受體系統(如G蛋白偶聯受體和受體酪氨酸激酶)介導的信號加以整合，起著多種信號交匯點或共同途徑的作用。ERK信號途徑是涉及調節細胞生長、發育及分化的信號網絡的核心，細胞內多種信號分子最終通過磷酸化ERK發揮生物學效應。在細胞分化、細胞增殖前期，細胞需要保證合成蛋白質、DNA、核糖體RNA以及膜物質等所需的代謝原料。有報道指出，這些代謝物質的合成調節均與ERK信號途徑息息相關［11］。

圖2 Ras-Raf-MEK-ERK信號途徑Fig.2 Ras－Raf－MEK－ERK signaling pathway［9］

2 ERK信號途徑與細胞凋亡

ERK對細胞凋亡的影響非常復雜。第一，ERK能夠活化核轉錄因子 －κB(nuclear factorkappa B，NF－κB)，進一步誘導抗凋亡基因(如Bcl－2、Bcl－xL)的表達，促進凋亡抑制蛋白 Bcl－2 磷酸化激活［12］。第二，可以通過降低促凋亡蛋白Bad磷酸化，及促進Bad、Bim降解，發揮抗凋亡作用［13］。第三，NF－κB 本身亦可對細胞凋亡產生抑制作用［14］。第四，抗肥胖藥來普汀(瘦素，leptin)能夠以劑量依賴的方式通過活化ERK抑制前列腺癌細胞DU145和PC3的凋亡［15］，而MEK抑制劑可以促進細胞凋亡或增敏細胞凋亡，在黑素瘤細胞中，應用MEK抑制劑能夠激活促凋亡蛋白，促進線粒體釋放凋亡誘導因子，激活半胱天冬酶3(caspase－3)，促進細胞凋亡［16］。第五，ERK 的磷酸化能夠使 Bad、Bim和 caspase－9等促凋亡蛋白磷酸化，發揮促凋亡作用；有報道表明，組蛋白脫乙酰酶抑制劑可以通過增加ERK磷酸化而促進腫瘤細胞的凋亡［17］；阿伐他汀{(3S，5S) －7－［2－(4－氟苯基)－3－苯基－4－(苯基氨基甲酰基)－5－異丙基吡咯－1－基］－3，5－二羥基庚酸，atorvastatin}能夠增加 ERK磷酸化，活化的ERK增加 Bim裂解，進而增加caspase－9 和 caspase－3 的 活性［18］。活化 的 ERK在不同的微環境中發揮的作用不同，可能是與其他途徑共同作用、相互影響的結果。

而動物被屠宰后，細胞內產生了凋亡信號，很有可能誘發肌細胞強制性死亡［14］。Ouali等［19］曾推斷，動物宰后應該有一個細胞凋亡的過程。因此可以認為，ERK可以通過對肌細胞凋亡的調控，進而對宰后肌細胞骨架和結構蛋白的降解進行調控。

3 ERK信號途徑與肌肉發育

肌細胞生成(myogenesis)主要是指在胚胎發育過程中，體節細胞經過一系列的增殖、遷移和分化，最終形成肌肉的過程，還包括成熟細胞的維持與組織再生等［20］。骨骼肌的生長速度最終取決于骨骼肌細胞的數量、肌肉蛋白質合成和降解速度［21］。大量研究表明，肌細胞類型是決定肉品質的重要因素［22］。Murgia 等［23］研究發現，去除神經支配后，慢型肌球蛋白重鏈(MyHC)被持續活化的Ras誘導，比目魚肌肉中肌細胞組成發生改變。Roth 等［24］研 究表明，MAPK 途 徑 中 的 Ras－Raf－MEK－ERK信號途徑可以上調慢型纖維MyHC的基因表達同時抑制快肌亞型表達。進一步研究表明，MAPK磷酸酶－1(MKP1)促使核內的MAPK去磷酸化而失活，可以有效地促進慢肌向快肌的轉化。而Shi等［25］則發現，ERK能夠優先活化快肌細胞。通過抑制ERK可以提升慢肌細胞特異的啟動子活性，并抑制快肌細胞表型相關的基因的表達，反之亦然。小鼠和大鼠中富含Ⅱb或Ⅱx型肌纖維的肌肉過表達MKP1后，檢測到有新生成的Ⅰ和Ⅱa型肌細胞。Chen等［26］采用RNA干擾技術研究發現人類腫瘤樣本中鈣蛋白酶與鈣蛋白酶抑制蛋白的比例(calpain/calpastatin)的增加與磷酸化的ERK活性增強有關。Rao等［27］在研究阿爾茨海默病(AD)時發現，鈣蛋白酶抑制蛋白基因表達沉默時，小鼠腦組織中鈣蛋白酶2蛋白活性增強，同時ERK信號途徑被激活。Figueiredo等［28］用轉基因小鼠證明，在神經組織中鈣蛋白酶1和鈣蛋白酶抑制蛋白發揮作用與MAPK信號途徑密切相關。

4 ERK信號途徑與宰后肌肉變化

4.1 宰后肌肉變化的信號級聯反應

普遍認為宰后冷藏過程中，肉品成熟嫩化的主要原因是組成細胞膜骨架的蛋白質的降解以及網狀結構的消失。肌細胞膜表面，存在一類細胞表面受體分子家族——整聯蛋白(integrins)，可使細胞黏附于胞外基質并介導來自基質的機械信號和化學信號，識別細胞外基質(extracellular matrix，ECM)蛋白，具有激活胞漿激酶、維持生長因子的生物活性、實現細胞外基質－整聯蛋白－肌細胞內的信號轉導的功能，調節肌細胞生長、分化、黏附等生理活動。

整聯蛋白信號系統由細胞內發出信號，調節細胞外整聯蛋白活性，或由細胞外基質發出結合信號轉導至細胞內(圖3)。該途徑可對肌細胞骨架多聚體進行組裝，誘導肌細胞骨架變化［29］；肌細胞骨架變化產生的機械作用力可調節核內基因的轉錄和表達，最終調節肌細胞的生長和分化功能。

圖3 整聯蛋白調節肌細胞生長的信號途徑Fig.3 Signaling pathway of integrin adhesion complex regulates growth of muscle cells

4.2 由ERK啟動整聯蛋白信號系統的肌細胞調節

當對生豬進行屠宰時，應激激活了下丘腦－垂體－腎上腺軸，導致垂體分泌的促腎上腺激素(ACTH)含量增加，同時，促腎上腺激素促進腎上腺分泌皮質醇，從而導致體內的一些內環境、免疫機能發生變化，機體通過這種變化來抵抗應激［30］。與此同時，位于海馬區的與恐懼調節相關的谷氨酸能信號會立即觸發大量信號途徑，這些信號中的一部分將會匯聚到共激活劑——ERK［31］。繼而，由ERK進一步調節其多種下游底物(圖4)［32］:細胞膜上的離子通道，神經纖維網上的細胞骨架蛋白［33］、下游90 ku核糖體 S6激酶(ribosomal S6 kinase，RSK)以及細胞核內的絲裂原和應 激 活 化 蛋 白 激 酶 (mitogen－and stress－activated protein kinase，MSK)。RSK和 MSK被認為是早期c-Fos基因的主要激活物［34］。這樣，通過MSK和RSK間接地激活基因表達，海馬區的ERK信號途徑就可以介導恐懼記憶的長期儲存，當再次受到刺激時，產生條件反射來抵抗應激。

圖4 應激時ERK的激活Fig.4 The activation of ERK under stress［32］

Raf－MEK－ERK 常規途徑被激活以后，存在多種機制對ERK信號途徑進行調節，新的一項研究指出:亞細胞定位作為一個與物理相關的調節方式，是ERK活性調節的主要途徑，動物受到應激刺激后，激活的ERK會移動到細胞核間隔中激活整聯蛋白系統［35］，進而觸發整聯蛋白信號系統對肌細胞骨架多聚體進行組裝，誘導肌細胞骨架變化。據此可以推測，動物屠宰后ERK信號途徑啟動后可能通過激活整聯蛋白信號系統，從而完成對動物宰后肌肉嫩化過程的調節。

5 小結

ERK及其信號途徑廣泛存在于多種組織細胞中，激活后參與多種因子的轉錄調控以及細胞活動的調節，同時由于其信號途徑的復雜性和多樣性，又具有使多條信號途徑匯聚并介導、觸發其他信號途徑的作用。因此，在屠宰后肌肉蛋白質降解、肌肉嫩化過程中，ERK及其信號途徑很可能發揮重要作用。而目前對ERK及其信號途徑的研究大部分停留在人類和動物的疾病預防及治療手段方面，在動物肉品質改良方面研究甚少。隨著ERK及其信號途徑的激活和抑制機制的逐漸明朗，ERK信號途徑對肌肉纖維的組成以及肉品嫩度的候選基因的影響也有了報道。所以，深入研究ERK及其信號途徑在動物肉品質方面的調控機理，便可以通過激活或抑制ERK及其信號途徑的活性來進一步調節和改善肉品質，可以說，在動物營養領域的研究中，ERK及其信號途徑極具研究前景。

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