彝族蟲類藥日本琵琶甲的化學成分研究

晏永明，呂 青，董小萍 ，李 艷，程永現 *

1中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室，昆明 650204;2成都中醫藥大學藥學院，成都 610075

日本琵琶甲(Blaps japonensis Marseul.)屬鞘翅目(Coleoptera)擬步甲科(Tenebrionidae)琵琶甲族(Blaptini)琵琶甲屬(Blaps)昆蟲。日本琵琶甲又稱臭殼子、臭屁蟲、打屁蟲等，在云南民間應用廣泛，尤其是彝族治療疑難雜癥處方中常用的藥用昆蟲，具有抗菌、消炎、解毒、消包塊、抗驚癇等作用［1］。目前國內外對其化學成分及生物活性研究較少，已有的研究表明同屬昆蟲中含有一些對苯二酚類和脂溶性成分等［2-5］。我們采用各種柱色譜從其50%乙醇提取物的正丁醇萃取部位分離得到10個化合物，所有化合物均系首次從該藥用昆蟲中分離得到。活性測試表明化合物1具有抑制脂多糖誘導的巨噬細胞一氧化氮產生作用。

1 儀器與材料

JASCO-20C型數字式旋光儀(日本);VG AUTO Spec-3000(英國VG公司)及Finnigan MAT 90質譜儀(德國 Finnigan公司);Bruker AM-400及 DRX-500 MHz核磁共振儀(TMS作為內標，δ為ppm，J為Hz);200～300目柱色譜用硅膠、硅膠H和GF254薄層色譜用硅膠(青島海洋化工廠);45～75 μm MCI gel CHP 20P(日本三菱公司產品);25～100 μm Sephadex LH-20(Pharmacia公司);40 ～63 μm RP-18(日本Daiso)。石油醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、甲醇等有機溶劑均為工業純經重蒸后使用。

日本琵琶甲樣品購自云南花鳥市場(采集自云南元江)，由中國科學院昆明動物研究所董大志研究員鑒定，標本(CHYX-0469)存于中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室。

2 提取與分離

日本琵琶甲5 kg，粉碎，50%乙醇冷浸動態提取3次，每次2 d，過濾，減壓回收乙醇得浸膏450 g，加水懸浮后依次用石油醚和正丁醇進行萃取，合并正丁醇萃取液，濃縮得到正丁醇部位140 g。正丁醇部位經硅膠柱色譜 (200～300目，1.5 kg)以氯仿－甲醇梯度洗脫得到5個組份 (Fr.1～Fr.5)。各組份經硅膠、MCI gel CHP 20P、Sephadex LH-20(甲醇)、RP-18反復柱層析，結合制備薄層色譜從由Fr.1獲得9(20 mg)、7(10 mg)和 8(7 mg);Fr.2 獲得 2(20 mg)、4(10 mg)和 6(12 mg);Fr.3 獲得 1(5 mg)，Fr.4 獲得3(40 mg)和10(5 mg)，Fr.5 獲得5(12 mg)。

3 結構鑒定

圖1 化合物1的主要HMBC和COSY相關Fig.1 Key HMBC and ROESY correlations of compound 1

3，4-Dihydroxyphenylacetic acid methyl ester(2)白色膠狀物。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:6.72-6.59(3H，m，Ar-H)，3.49(2H，s，H-1')，3.63(3H，s，OCH3);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:125.9(C-1)，115.5(C-2)，143.1(C-3)，143.8(C-4)，116.3(C-5)，121.6(C-6)，40.4(C-1')，173.8(C-2')，52.4(OCH3)。以上數據與文獻數值相符［7］。

Hydroxytyrosol(3) 白色膠狀物。1H NMR(400 MHz，CD3COCD3)δ:6.70(1H，d，J=1.9 Hz，H-2)，6.69(1H，d，J=8.1 Hz，H-5)，6.52(1H，dd，J=8.1，1.9 Hz，H-6)，2.63(2H，t，J=7.2 Hz，H-1')，3.65(2H，t，J=7.2 Hz，H-2')，7.81(2H，brs，Ar-OH);13C NMR(100 MHz，CD3COCD3)δ:131.7(C-1)，116.8(C-2)，144.1(C-3)，145.6(C-4)，115.9(C-5)，120.9(C-6)，39.6(C-1')，64.2(C-2')。以上數據與文獻數值基本相符［8］。

3，4-Dihydroxy-β-methoxyphenethyl alcohol(4)白色膠狀物。1H NMR(400 MHz，CD3COCD3)δ:6.80(1H，d，J=2.1 Hz，H-2)，6.78(1H，d，J=7.8 Hz，H-5)，6.63(1H，dd，J=7.8，2.1 Hz，H-6)，4.08(1H，dd，J=7.9，4.0 Hz，H-1')，3.55(1H，dd，J=11.3，8.2 Hz，H-2'a)，3.43(1H，brd，J=10.7 Hz，H-2'b)，3.58(1H，brs，2'-OH)，3.18(3H，s，OCH3)，7.88(1H，brs，Ar-OH);13C NMR(100 MHz，CD3COCD3)δ:132.1(C-1)，115.8(C-2)，145.5(C-3)，145.9(C-4)，114.7(C-5)，119.5(C-6)，86.7(C-1')，67.8(C-2')，56.6(OCH3)。以上數據鑒定化合物4結構為3，4-Dihydroxy-β-methoxyphenethyl alcohol，并對其核磁共振數據首次進行了歸屬。

(S)-(+)-2-(3，4-Dihydroxy phenyl)-2-ethoxylethanol(5) 白色膠狀物。1H NMR(400 MHz，CD3COCD3)δ:6.81(1H，d，J=1.9 Hz，H-2)，6.78(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.65(1H，dd，J=8.0，1.9 Hz，H-6)，4.20(1H，d，J=8.0，4.1 Hz，H-2')，3.37(4H，m，H-1，H-1'')，1.11(3H，t，J=7.0 Hz，H-2'')，3.66(1H，brs，2'-OH)，7.88(2H，brs，Ar-OH);13C NMR(100 MHz，CD3COCD3)δ:132.6(C-1)，114.6(C-2)，145.8(C-3)，145.4(C-4)，115.8(C-5)，119.3(C-6)，67.9(C-1')，83.7(C-2')，64.5(C-1'')，15.6(C-2'')。以上數據與文獻數值相符［9］。

3-Hydroxy-4-methoxy-phenylmethylcarbinol(6)白色固體。1H NMR(500 MHz，CD3COCD3)δ:6.67(1H，d，J=3.0 Hz，H-2)，6.60(1H，d，J=8.6 Hz，H-5)，6.52(1H，dd，J=8.6，3.0 Hz，H-6)，4.65(1H，q，J=6.5 Hz，H-1')，1.33(3H，d，J=6.5 Hz，H-2')，3.23(3H，s，OCH3);13C NMR(100 MHz，CD3COCD3)δ:131.1(C-1)，115.6(C-2)，148.8(C-3)，151.4(C-4)，113.6(C-5)，117.1(C-6)，75.8(C-1')，22.6(C-2')，56.7(OCH3)。以上數據與文獻數值相符［10］。

4-Hydroxybenzoic acid(7) 白色粉末。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:6.71(1H，d，J=8.5 Hz，H-3，5)，7.79(1H，d，J=8.5 Hz，H-2，6);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:127.7(C-1)，132.5(C-2，6)，115.5(C-3，5)，161.6(C-4)，174.1(COOH)。以上數據與文獻數值相符［11］。

原兒茶醛(8) 白色粉末。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:7.30(2H，brs，H-2，6)，6.91(1H，brd，J=5.1 Hz，H-5)，9.67(1H，s，CHO);13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:130.7(C-1)，116.2(C-2)，147.1(C-3)，153.7(C-4)，119.4(C-5)，126.5(C-6)，193.1(CHO)。以上數據與文獻數值相符［12］。

Ethyl β-D-xylobioside(9) 白色固體。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:4.21(1H，d，J=7.0 Hz，H-1)，3.14(1H，m，H-2)，3.33(1H，t，J=8.1 Hz，H-3)，3.50(1H，overlap，H-4)，3.50(1H，overlap，H-5a)，3.21(1H，dd，J=11.0，9.8 Hz，H-5b)，3.80(2H，m，C-1')，1.14(3H，t，J=7.2 Hz，C-2');13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:104.3(C-1)，74.2(C-2)，77.3(C-3)，70.8(C-4)，66.0(C-5)，65.0(C-1')，15.4(C-2')。以上數據與文獻數值相符［13］。

Butyl β-D-xylobioside(10)白色固體。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ:4.21(1H，d，J=7.0 Hz，H-1)，3.15(1H，m，H-2)，3.33(1H，t，J=8.2 Hz，H-3)，3.45(1H，overlap，H-4)，3.50(1H，overlap，H-5a)，3.17(1H，m，H-5b)，3.79(2H，m，C-1')，1.52(2H，m，H-2')，1.35(2H，q，J=7.6 Hz，H-3')，0.88(3H，t，J=7.4 Hz，H-4');13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ:104.5(C-1)，74.1(C-2)，77.1(C-3)，70.7(C-4)，66.0(C-5)，69.4(C-1')，32.5(C-2')，19.8(C-3')，14.1(C-4')，以上數據與文獻數值相符［13］。

4 活性測試

化合物1為具有五元不飽和內酯環的結構，為此我們對其進行了生物活性測試。應用脂多糖(LPS)和 IFN-γ刺激 RAW264.7細胞，然后應用Griess試劑測定細胞培養上清液中NO2-水平以反映誘導型一氧化氮合成酶的總體酶活。采用MTT［14］法測定細胞存活量，應用 Reed and Muench［15］法計算化合物的IC50值。結果表明化合物1可顯著抑制LPS誘導的RAW264.7產生一氧化氮，其IC50值為14.8 μg/mL，提示化合物1可能具有抗炎或抗腫瘤作用，與該昆蟲的傳統功效有密切關聯。

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