紫苤藍(lán)花青素合成酶基因BocANS的克隆與分析

袁菱婧，羅 盼，蔣 明，李溫平，何建婷

(臺(tái)州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臨海 317000)

花青素又稱花色素、花色苷，在植物中廣泛分布，是一類重要的次生代謝產(chǎn)物，決定葉、花和果實(shí)等的顏色，在吸引昆蟲、鳥類和獸類傳粉或傳播種子等方面起著重要作用［1］?；ㄇ嗨鼐哂锌拐T變、抗氧化、抗菌和抗高血壓等功效，因此，在食品加工上得到了廣泛應(yīng)用，常用作天然的食品添加劑和著色劑［2－3］?；ㄇ嗨睾铣擅甘腔ㄇ嗨厣锖铣傻年P(guān)鍵酶，作用于合成途徑的倒數(shù)第二步，催化無色花色素轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩ㄉ兀?］。近年來，科研人員對(duì)花青素合成酶的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、基因克隆和表達(dá)等方面開展了廣泛研究，并取得了一定進(jìn)展［5－8］。

紫苤藍(lán) (Brassica oleraceavar．caulorapa)，又名紫球莖甘藍(lán)、紫擘藍(lán)和紫芥藍(lán)頭等，為十字花科蕓薹屬蔬菜，原產(chǎn)地中海沿岸，作為特種蔬菜從國(guó)外引進(jìn)栽培。紫苤藍(lán)具紫色膨大的球莖，形態(tài)奇特、色澤亮麗，有一定的觀賞價(jià)值，可用于庭院栽培或盆栽;球莖肉質(zhì)脆嫩可口、風(fēng)味獨(dú)特，可生吃、熟食或腌制，深受人們的喜愛［9］。近年來，在紫苤藍(lán)栽培技術(shù)、指紋圖譜、小孢子培養(yǎng)和組培快繁等方面有一些研究［9－13］，但有關(guān)花青素合成酶基因克隆方面未見報(bào)道。本研究以紫苤藍(lán)為材料，通過花青素合成酶基因的克隆、表達(dá)和序列分析，為該基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

在花期采集紫苤藍(lán)的葉柄、葉片、莖、花柄和花蕾，用75%的酒精擦拭后置于液氮，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。Taq酶購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，dNTP購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，TRIzol?試劑購(gòu)自Invitrogen公司，cDNA合成試劑盒采用SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit，購(gòu)自 TaKaRa公司;PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;pGEM T-easy載體購(gòu)自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和cDNA的合成

葉柄、葉片、莖、花柄和花蕾RNA的分離采用TRIzol法，稱取約0.1 g樣品用于RNA的提取;cDNA第1鏈和第2鏈的合成按照試劑盒中提供的說明書進(jìn)行。

1.2.2 基因的克隆

以葉片 cDNA 為模板，BocP1(5’-ATGGTGGCAGTTGAAAG-3’) 和 BocP2(5’-TCAGACTTCATCCTTT-3’)為引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。在20 μL體系中，分別加入 cDNA模板40 ng，Taq酶 1 U，Taq酶緩沖液 2 μL，10 mmol·L－1的dNTP 0.5 μL，20 μmol·L－1的引物各 0.5 μL，并用無菌dd H2O補(bǔ)足20 μL。PCR程序?yàn)?94℃預(yù)變性 5 min，每個(gè)循環(huán)包括 94℃變性 30 s，55.6℃退火60 s，72℃延伸90 s，共32次，最后72℃繼續(xù)延伸 10 min。PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，經(jīng)割膠、回收和純化后，克隆到pGEM T-easy載體，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、菌液PCR驗(yàn)證后挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.2.3 基因的表達(dá)分析

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)RT-PCR引物用于表達(dá)分析，上、下游引物序列分別為 BocRT1(5’-GCTCAAGAAGGCGGCTAT-3’) 和 BocRT2(5’-CCAATCCACGGTGAAGTA-3’)。分別以 40 ng葉柄、葉片、莖、花柄和花蕾cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系同1.2.2。PCR程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30 s，53.8℃退火40 s，72℃延伸45 s，共33次。

2 結(jié)果與分析

2.1 BocANS基因的克隆

以BocP1和BocP2為PCR引物，從葉片cDNA中擴(kuò)增到與預(yù)期大小一致的條帶，經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化和測(cè)序，獲得BocANS基因的序列。BocANS的編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 077 bp，編碼358個(gè)氨基酸，A，C，G，T 4種堿基分別為 326，206，287和 258個(gè)，GC值45.78% (圖1)。在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的結(jié)果表明，BocANS與甘藍(lán)花青素合成酶基因的序列最為相似，一致性達(dá)99%，僅存在3個(gè)堿基的差異，與白菜有96%的相似性，存在4個(gè)堿基的差異;通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)，BocANS的編碼蛋白含兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，分別為 2OG-FeII_ Oxy和DIOX_N。

圖1 紫苤藍(lán)BocANS基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 BocANS基因的表達(dá)分析

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)RT-PCR引物BocRT1和BocRT2以等量的葉柄、葉片、莖、花柄和花蕾為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。RT-PCR結(jié)果 (圖2)表明，BocANS在葉片、葉柄、莖、花柄和花蕾中均有表達(dá)，在葉柄和莖中的表達(dá)量較高，而其他部位相對(duì)較低。

2.3 BocANS的序列分析

圖2 BocANS基因的表達(dá)模式

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載甘藍(lán) (登錄號(hào)AAO73440，后略)、芥菜 (B．juncea，ACH58397)、桃形李(Prunus salicinavar．cordata，AEN19292)、蘋 果(Malusxdomestica，BAB92998)、甘薯 (Ipomoeabatatas，ADE08370)、 圓 葉 牽 牛 (I．purpurea，ABW69684)、王妃藤 (I．horsfalliae，ACS71531)、牽牛 (I．nil，BAB71810)、水稻 (Oryza sativa，CAA69252)和 小 麥 (Triticumaestivum，BAE98277)的氨基酸序列，用Clustalx 1.81進(jìn)行序列比對(duì)，再用 Mega 3.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖3)，構(gòu)建方法為鄰接法 (Neighbor-joining)，經(jīng)1 000次自舉檢驗(yàn)。

結(jié)果表明，11條氨基酸序列的長(zhǎng)度范圍為357～438，殘基之間存在一定的差異。紫苤藍(lán)與甘藍(lán)ANS之間的差異最小，僅存在個(gè)別殘基的差異，兩者的遺傳距離0.008 7;紫苤藍(lán)、甘藍(lán)與小麥ANS之間的差異最大，兩者的遺傳距離均為0.783 8。從系統(tǒng)發(fā)育樹上看，3種蕓薹屬蔬菜即紫苤藍(lán)、甘藍(lán)與芥菜聚為一組，薔薇科的桃形李與蘋果聚為一組，旋花科的王妃藤、甘薯、圓葉牽牛和牽牛處于同一分支，而單子葉植物小麥和水稻單獨(dú)聚為一組 (圖3)。

圖3 用NJ法構(gòu)建的花青素合成酶基因編碼蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹

3 小結(jié)和討論

在自然界中，存在多種類型的植物色素，如類黃酮、類胡蘿卜素、多酚化合物和生物堿類等?；ㄇ嗨貙儆陬慄S酮物質(zhì)，基本結(jié)構(gòu)為2-苯基苯并吡喃，環(huán)上的氫被羥基或甲氧基取代后生成不同類型的花色素。由于花青素具有較好的保健和藥用功效，富含花青素的作物如紫甘薯、紫苤藍(lán)、紫菜薹、紫玉米、紫花生和黑豆等深受消費(fèi)者的歡迎。通過基因工程，在植物或微生物中導(dǎo)入花青素合成酶基因獲得高含量花青素已成為可能。近年來在蔬菜、食品、飼料和制藥行業(yè)中已得到了應(yīng)用［14－15］。目前，科研人員已從紫甘薯、紫菜薹等紫色作物中克隆得到花青素合成酶基因［1，16］。

本研究從紫苤藍(lán)中克隆到一個(gè)花青素合成酶基因，該基因的開放閱讀框大小與實(shí)驗(yàn)室先前在紫菜薹中克隆到的BcANS一樣，均為1 077 bp，編碼358個(gè)氨基酸［16］;RT-PCR 結(jié)果表明，BocANS在葉片、葉柄、莖、花柄和花蕾中表達(dá)，表達(dá)模式與BcANS類似，推測(cè)它們?yōu)橥椿?。BocANS的堿基組成、序列長(zhǎng)度與同屬植物十分接近，但與不同科植物相比，堿基組成和長(zhǎng)度差異較大，說明ANS在進(jìn)化上比較保守，這一規(guī)律與傳統(tǒng)的植物分類相吻合。紫苤藍(lán)花青素合成酶基因的克隆，為研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)，下一步將構(gòu)建植物表達(dá)載體和開展轉(zhuǎn)基因研究。

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