pVAX-iNOS真核表達載體的構建及其抗肺癌作用研究

葉蘇娟 楊蔚菡 王宇 歐文婧 馬清平 朱文

肺癌在全世界范圍內是發病率和死亡率最高的惡性腫瘤。常規的放化療和手術治療是肺癌的基本治療方法，但大部分患者在確診時已經發生遠處轉移，常規治療手段很難取得較好的臨床治療效果。因此，尋找新的治療方法非常重要。而肺癌是一個多基因異常導致的疾病。目前基因治療已被認為是一種極具前景的腫瘤治療方法。

一氧化氮（nitric oxide, NO）作為一種多功能的小分子物質和人體內重要的信號傳遞因子之一，是目前國內外腫瘤領域最新研究熱點[1,2]。誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）是內源性NO合成的關鍵酶[3]。iNOS基因在生理狀態下不表達或僅少量表達，而在細胞因子等刺激下誘導型表達并產生高水平NO[4]。在腫瘤研究[5-12]中，高濃度的NO可通過細胞毒作用減緩腫瘤的生長和轉移、抑制血管生成、促進分化和凋亡而起到一種抗腫瘤效應。因此，倘若能通過提供NO供體藥物或基因轉染的方法增加iNOS基因的表達并誘導生成高濃度的NO對惡性腫瘤治療來說將是一個潛在的優勢[13]。目前有研究[14-20]報道，將iNOS基因轉染到乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、腎癌、甲狀腺瘤等腫瘤后均表現出一種強烈的抗腫瘤效應。然而，至今關于iNOS基因在肺癌中的基因治療還沒有研究報道。關于iNOS基因在肺癌細胞和組織中的表達水平，研究[5,21,22]報道其總體趨于一種中等量表達的關系，產生的低濃度NO可以促進腫瘤細胞的生長，而高水平的NOS是非小細胞肺癌患者預后的一個有利的因素。因此，通過誘導肺癌細胞iNOS基因表達從而激發肺癌細胞釋放大量NO可能是抗肺癌治療的一個新的方法。

本研究擬構建pVAX-iNOS真核表達質粒載體，初步探討轉染A549細胞后iNOS在mRNA和蛋白表達水平的變化及誘導肺癌細胞發生凋亡及抑制細胞增殖和遷移的作用。本研究將為肺癌基因治療奠定基礎，是臨床肺癌基因治療的一個新的探索。

1 材料和方法

1.1 材料 人iNOS質粒iNOS-pCR4-TOPO購自美國Open Biosystems公司。真核表達質粒載體pVAX購自美國Invitrogen公司。人肺腺癌細胞株A549購自美國ATCC（American Type Culture Collection）。大腸桿菌JM109購自美國Clontech公司，由本實驗保種。四氫生物蝶呤（BH4）購于美國Sigma公司。T4 DNA連接酶、HindIII和XbaI限制性內切酶購自美國Fermentas公司；PCR Kit、膠回收試劑盒購自日本Takara公司；質粒提取試劑盒購自德國Qiagen公司；Trizol試劑盒和LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；Hoechst 3235購于美國Sigma公司；Anti-iNOS購自Abcam公司；HRP標記二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；化學發光檢測試劑盒購自天根生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司；PVDF膜（0.22 μm）購自Millipore公司；其它試劑均為國產分析純試劑。6孔板購自美國Coster公司。

1.2 方法

1.2.1 pVAX-iNOS真核表達質粒的構建 本實驗將購買的iNOS-pCR4-TOPO菌株直接進行劃平板、次日挑取單克隆并進行進一步擴大培養，將培養的菌液進行小量質粒提取。然后以iNOS-pCR4-TOPO質粒為模板，采用RTPCR的方法，擴增iNOS基因的編碼區序列并重新連接到pVAX載體上，構建含卡那霉素抗性的真核表達質粒pVAX-iNOS。以iNOS在GenBank中的序列BC130283.1為模板，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物：上游引物：5'-CGATGGAAAGCTTGCTGTAGAGATGGCCTGTCCTT GGAAATTTCTGT-3'（酶切位點HindIII）；下游引物：5'-GACGAGGTCTAGATGCCGGCAGCTTTAACCCCTCC TGTAG-3'（酶切位點XbaI）。PCR產物長度為3,528 bp。高保真PCR反應體系按試劑盒說明書進行。PCR擴增條件為：94oC變性2 min后進入25個PCR循環（94oC、30 s，62oC、30 s，72oC、3.5 min），72oC、10 min，4oC保存。擴增全長iNOS基因序列后，1%瓊脂糖電泳鑒定PCR產物，載體和PCR產物經限制性內切酶HindIII、XbaI酶切純化后，將iNOS定向插入pVAX的多克隆位點，轉化JM109感受態細胞以卡那霉素篩選陽性克隆，經酶切鑒定正確的克隆由上海Invitrogen公司進行測序。

1.2.2 pVAX-iNOS真核表達質粒的細胞轉染 按照Lipofectamine 2000說明書進行操作。本實驗均分3組：空白組、pVAX組和pVAX-iNOS組。取對數生長期A549細胞接種于6孔板或96孔板，當細胞融合率達到60%時，將pVAX、pVAX-iNOS質粒分別與Lipofectamine 2000在室溫下共同孵育20 min后進行瞬時轉染，未轉染的A549細胞及轉染空載體pVAX的細胞作為陰性對照。次日給予1×10-5mol/L BH4[16]（下述所有實驗瞬時轉染次日均給予相同濃度BH4處理）。轉染48 h后分別收集細胞進行后續實驗。

1.2.3 RT-PCR檢測iNOS在mRNA水平的表達 以Lipofectamine 2000介導pVAX、pVAX-iNOS質粒分別轉染A549細胞，方法同上，以未轉染的A549細胞和轉染空載體pVAX的細胞為陰性對照。48 h后收取細胞用Trizol法提取細胞總RNA，RT-PCR參閱試劑盒說明書進行。利用Primer Premier 5.0軟件設計iNOS檢測引物序列：上游引物：5'-CCTGAGCTCTTCGAAATCCCACCTGAC-3'，下游引物：5'-AAACTATGGAGCACAGCAATG-3'，PCR產物332 bp。反應條件：94oC變性5 min后進入30個PCR循環（94oC、30 s，58oC、45 s，72oC、45 s），4oC保存。β-actin：上游引物：5'-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCT TG-3'，下游引物：5'-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTT G-3'，產物長度：135 bp。反應條件：94oC變性3 min后進入35個PCR循環（94oC、30 s，57.4oC、45 s，72oC、1 min），4oC保存。1%瓊脂糖電泳鑒定PCR擴增產物。

1.2.4 Western blot檢測iNOS蛋白表達水平 以Lipofectamine 2000介導pVAX、pVAX-iNOS質粒轉染A549細胞，方法同上，以未轉染的A549細胞和轉染空載體pVAX的細胞為陰性對照。48 h后收取細胞制備蛋白樣品，以BCA法進行蛋白定量。將等質量的蛋白進行15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉PVDF膜，電壓為86 V，時間90 min。5%脫脂奶粉4oC封閉2 h，TBST洗膜后，分別加一抗（兔抗人iNOS單抗和鼠抗人β-actin多抗，均為1:500），4oC孵育過夜， TBST洗膜3次；加 HRP標記二抗（兔抗鼠 IgG 1:5,000）， 37oC孵育1 h，TBST洗膜3次，等量的ECL反應液A和B混合后加至膜上，顯影。

1.2.5 pVAX-iNOS真核表達質粒轉染對A549細胞生長的影響 以Lipofectamine 2000介導pVAX、pVAX-iNOS質粒轉染A549細胞，方法同上，以未轉染的A549細胞和轉染空載體pVAX的細胞為陰性對照。轉染24 h、48 h和72 h后加入MTT工作液（5 mg/mL PBS配制）20 μL/孔，37oC 5%CO2培養箱孵育3 h，棄上清加入150 μL DMSO室溫振蕩混勻后測A490吸光值。每個濃度梯度做3個復孔，實驗重復3次。

1.2.6 pVAX-iNOS真核表達質粒轉染對A549細胞凋亡的影響 以Lipofectamine 2000介導pVAX、pVAX-iNOS質粒轉染A549細胞，方法同上，以未轉染的A549細胞和轉染空載體pVAX的細胞為陰性對照。48 h后加入5 mL新鮮配制的卡諾氏固定液（甲醇:冰乙酸=1:3，現用現配），靜置10 min-15 min，棄去固定液，再加入卡諾氏固定液，靜置10 min-15 min，重復1次。棄去固定液后于空氣中干燥5 min。加入1 mL 0.5 μg/mL的Hoechst 3235避光染色30 min，PBS清洗2次，每次5 min，熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞的形態（是否有凋亡小體形成）。

1.2.7 pVAX-iNOS真核表達質粒轉染對A549細胞遷移能力的影響 在6孔板中以Lipofectamine 2000介導pVAX、pVAX-iNOS質粒轉染A549細胞，方法同上，以未轉染的A549細胞和轉染空載體pVAX的細胞為陰性對照。24 h后，在各組單層細胞中間劃出一道裸露無細胞帶，PBS洗滌3次后加入1%血清的1640培養基培養。劃痕0 h、6 h、12 h、24 h、36 h和48 h后，取寬度相等的位置觀察細胞遷移的情況，于倒置顯微鏡下觀察照相。

1.3 統計學分析 采用SPSS 13.0進行統計學分析，結果以Mean±SD表示，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 真核表達質粒載體pVAX-iNOS的構建、鑒定和測序以iNOS-pCR4-TOPO為模板，通過高保真RT-PCR擴增iNOS目的片段，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳結果表明，iNOS片段大小正確（大小為3,528 bp）。將該iNOS PCR產物片段和pVAX載體直接進行HindIII和XbaI雙酶切。iNOS經HindIII和XbaI酶切后約為3,512 bp。pVAX載體經HindIII和XbaI酶切后由環狀結構（大小為3,000 bp）變為2,920 bp的單鏈結構。然后將兩酶切產物純化后經T4連接酶進行連接，最后得到真核表達質粒載體pVAX-iNOS（大小為6,432 bp）。經初步電泳篩選正確后，將構建的pVAX-iNOS質粒載體進行PCR和雙酶切鑒定。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，iNOS片段大小約為3,528 bp；雙酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，pVAX-iNOS質粒載體經HindIII和XbaI雙酶切后得到3,512 bp和2,920 bp左右兩條帶，與預期結果一致（圖1）。陽性克隆測序結果顯示真核表達質粒載體pVAX-iNOS構建成功。

2.2 真核表達質粒轉染后A549細胞中iNOS的表達檢測 以Lipofectamine 2000介導pVAX、pVAX-iNOS質粒分別轉染A549細胞，以未轉染的A549細胞及轉染空載pVAX的細胞為陰性對照。48 h后分別提取各處理組A549細胞的細胞總RNA，并逆轉錄為cDNA，RT-PCR檢測結果顯示iNOS轉染后在A549細胞中表達升高（條帶大小為332 bp）；相同轉染方法處理A549細胞48 h后收取細胞總蛋白，Western blot檢測結果顯示iNOS在轉染pVAX-iNOS后的A549細胞中表達上調，相對分子質量約為135 kDa，與預期大小相符（圖2）。

2.3 真核表達質粒轉染對A549細胞生長的影響 真核表達質粒pVAX-iNOS分別轉染A549細胞24 h、48 h和72 h后，通過MTT法對細胞的生長活力進行測定。結果顯示，基因轉染24 h時，細胞相對生長活力為89.83%，而轉染48 h時，細胞生長活力明顯受到抑制，達到約58.33%，而72 h時細胞生長活力約為47.88%（圖3，P＜0.01）。可以看出，基因轉染48 h時，細胞的生長變化相對最為明顯。

圖1 真核表達質粒pVAX-iNOS的構建。A：質粒pVAX-iNOS的構建。M：Marker（DL2000）； 1：iNOS PCR產物；2：iNOS PCR產物被HindIII和XbaI進行切割并純化；3：載體pVAX被HindIII和XbaI進行切割并純化；4：陽性克隆的PCR鑒定；5：陽性克隆的雙酶切鑒定；B：陽性克隆的測序鑒定（因序列過長，此處只顯示以起始碼開始的部分測序結果）。Fig 1 Construction of eukaryotic expression plasmid pVAX-iNOS. A：Construction of pVAX-iNOS plasmid.M: Marker (DL2000); 1: PCR products of iNOS; 2: The digested and purified PCR products; 3: The digested and purified pVAX; 4: The positive clones confirmed by PCR; 5: The positive clones confirmed by double restriction enzyme digestion; B: Sequencing analysis of the positive clones (part of the sequence).

圖2 RT-PCR和Western blot檢測A549細胞轉染pVAX-iNOS 48 h后iNOS基因的mRNA和蛋白表達水平及其灰度值分析（**P＜0.01）。A：RT-PCR檢測空白組、pVAX和pVAX-iNOS轉染組A549細胞中iNOS的mRNA表達水平及灰度值分析；B：Western blot檢測空白組、pVAX和pVAX-iNOS轉染組A549細胞中iNOS的蛋白表達水平及灰度值分析。Fig 2 The mRNA and protein expression levels of iNOS in A549 cells transfected with pVAX-iNOS for 48 h by RT-PCR and Western blot analysis (**P＜0.01). A:The mRNA expression level of iNOS in A549 cells with different treatments by RT-PCR analysis; B: The protein expression level of iNOS in A549 cells with different treatments by Western blot analysis.

圖3 MTT法檢測轉染pVAX-iNOS基因對A549細胞生長的影響（**P＜0.01）Fig 3 Inhibition of cell proliferation of A549 cells after transfection of pVAX-iNOS for 24 h, 48 h and 72 h by MTT assay (**P＜0.01)

圖4 Hoechest 3235染色檢測A549細胞轉染pVAX-iNOS 48 h后的細胞凋亡形態Fig 4 Induction of apoptosis of A549 cells transfected with pVAX-iNOS for 48 h by staining with Hoechst 3235

圖5 劃痕實驗檢測pVAX-iNOS轉染對A549細胞遷移能力的影響Fig 5 Effect of the enhanced expression of iNOS on the migration ability of A549 cells transfected with pVAX-iNOS by a scratch assay

2.4 真核表達質粒轉染對A549細胞凋亡的影響 將pVAX-iNOS質粒轉染A549細胞，以未轉染和僅轉染空載體pVAX的細胞為陰性對照。轉染48 h后觀察到細胞生長受到抑制。Hoechst 3235染色后，經電子熒光顯微鏡下觀察可見，經pVAX-iNOS轉染的細胞在紫外光激發時發出明亮的藍色熒光，核出現固縮裂解為碎塊，產生明顯的凋亡小體（圖4）；轉染了空載體或未轉染的細胞生長狀態良好，幾乎看不見凋亡小體。該結果表明pVAX-iNOS質粒在體外具有明顯誘導肺癌細胞A549凋亡的作用。

2.5 真核表達質粒轉染對A549細胞遷移能力的影響 真核表達質粒pVAX-iNOS轉染A549細胞，以未轉染的A549細胞和僅轉染空載體pVAX的細胞為陰性對照。轉染24 h后，在各組單層細胞中間劃出一道裸露無細胞帶，取寬度相等的位置觀察細胞遷移的情況。0 h時現各組細胞劃痕邊緣整齊，6 h、12 h和24 h后各組劃痕邊緣變得稍模糊，空白組及pVAX組的細胞向裸露的中間區域遷移，pVAX-iNOS組的細胞劃痕邊緣雖有模糊，但未見有細胞脫離，考慮為轉染導致部分細胞壞死或凋亡所致。36 h后空白組及pVAX組的細胞繼續向中間區域生長，48 h后可明顯觀察到空白組及pVAX組的劃痕區域變窄，而pVAX-iNOS僅有少部分細胞向中間遷移生長，劃痕區域清晰可見（圖5）。該結果表明pVAX-iNOS質粒在體外轉染肺癌細胞A549具有明顯抑制細胞發生遷移的作用。

3 討論

肺癌在全世界范圍內是發病率和死亡率最高的惡性腫瘤。肺癌的發生和轉移與多種基因的異常表達及相互作用密切相關。基因治療已被認為是一種極具前景的腫瘤治療方法。近年來，NO的雙重生物學效應在腫瘤研究中得到了普遍重視，一方面，腫瘤細胞iNOS持續產生合適濃度NO可作為重要的信使分子，調節與細胞增殖相關基因的表達，增加腫瘤血供和血管形成，促進腫瘤增殖；另一方面，高濃度的NO對細胞又是一種損害，可通過細胞毒作用減緩腫瘤的生長和轉移，抑制血管生成、促進分化和凋亡而起到抗腫瘤效應[5-8]，同時，研究[7-12]表明，高表達iNOS可抑制肝癌、惡性黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌等腫瘤的致瘤性和轉移特性，并且還可提高結直腸癌[23]、卵巢癌[24]和非小細胞肺癌[21]等患者的存活率。因此，通過激發腫瘤細胞釋放大量的NO可能是抗腫瘤治療的一個新的方法[13]。

外源性誘導iNOS基因表達的方法包括NO供體藥物、細胞因子和功能性iNOS基因的轉染，但全身高濃度給予NO供體藥物容易導致低血壓的發生，細胞因子刺激法和NO供體法存在耐藥性差、副反應大、特異性不強、毒性大等缺點，因此臨床上應用存在一定困難[18,25]，而iNOS基因轉染可基本避免細胞因子刺激法和NO供體法的缺陷，目前已經在乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、腎癌、甲狀腺瘤等腫瘤中對iNOS轉基因后產生的抗腫瘤效應進行了研究[14-20]。

Soler等[14]首次報道在甲狀腺瘤模型中，iNOS可作為一個自殺基因進行治療，并表現出一種強烈的抗腫瘤效應。盡管質粒的轉染效率比較低，由于NO的彌散可導致強烈的旁觀者效應，iNOS基因的抗腫瘤效應非常明顯，且iNOS基因在腫瘤中可被可靠地定向到腫瘤細胞而避免產生全身毒性作用。同樣，在黑色素瘤和腎癌細胞中也發現了類似的旁觀者效應[15]。Jenkins等[26]將iNOS基因轉染入結腸癌細胞后，持續分泌大量NO，并可抑制腫瘤細胞的增殖能力。Xie等[27]對荷瘤小鼠（K-1753細胞）給予iNOS基因治療后，腫瘤出現了明顯的生長抑制；體外實驗也同樣證實，通過轉染iNOS基因可導致腫瘤細胞發生溶解和誘導旁細胞發生凋亡。Worthington等[20]通過使用輻射誘導型啟動子（野生型激活片段1，WAF1）和陽離子脂質體將iNOS基因轉染到腫瘤細胞后觀察其對腫瘤細胞及其血管的影響，結果發現轉染后可使鼠尾動脈擴張65%，從而增加傳統的分次（割）放射治療的潛在療效；并且，轉基因后還可延遲腫瘤的生長和促進腫瘤細胞發生凋亡。Adams等[16]通過將iNOS基因治療和化療藥物順鉑聯合對前列腺癌細胞株進行研究，觀察iNOS轉染后在大部分細胞中均顯示了細胞毒作用，同時發現iNOS基因轉染還可極大地提高順鉑的細胞毒效應。這些研究均發現，iNOS基因治療在很大程度上能通過抑制腫瘤細胞生長、增殖、促進腫瘤細胞發生凋亡以及對周圍腫瘤細胞產生旁觀者效應等產生抗腫瘤效應。

在本研究中，我們通過高保真RT-PCR擴增iNOS目的片段，成功構建了真核表達質粒載體pVAX-iNOS。本研究選用的真核表達載體為pVAX，該質粒含有真核基因表達調控序列、CMV啟動子有一個多克隆位點區，卡那霉素抗性和SV40加尾信號，在真核細胞內有高效表達活性，便于對質粒進行體外高效轉染和體內治療研究。通過陽離子脂質體轉染的方法，本研究首次將pVAX-iNOS和pVAX轉染A549肺癌細胞，在mRNA水平和蛋白水平檢測到該基因表達上調；隨后經MTT法對轉染24 h、48 h和72 h的細胞進行生長活性檢測，結果發現轉基因可明顯抑制A549肺癌細胞的增殖作用，尤以48 h相對抑制最為明顯，考慮多為iNOS基因轉染48 h后表達量最高，故其抗腫瘤作用亦最為明顯；Hoechst染色和劃痕試驗發現，與空白組及空載體組相比，轉染pVAX-iNOS質粒可明顯誘導A549肺癌細胞發生凋亡及抑制細胞遷移。然而，肺癌的發生、發展是一個復雜的過程，涉及到多基因的異常作用以及各種其它因素的影響，因此通過基因治療相互聯合或基因治療與化療藥物或放射治療聯合將極大地提高腫瘤基因治療的效果。在下一步實驗中，我們將聯合化療藥物或放射治療，并通過動物實驗進一步研究pVAX-iNOS基因治療對肺癌的抑制作用及抗腫瘤機制。本研究為將來肺癌基因治療奠定了一定的研究基礎，是臨床肺癌基因治療的一個新的探索。