TIMP-3和mtp53在非小細胞肺癌中的表達及意義

楊紅 李婕 郭嘉 張尚福

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，患者的5年和10年生存率分別為14%和8%[1]。近年來肺癌的診斷和治療技術(shù)取得了一定進步，但肺癌患者的生存率并未明顯提高。肺癌常在早中期發(fā)生鄰近組織、器官的浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，是其治療失敗的主要原因。基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-3（tissue inhibitor of metalloproteinases-3,TIMP-3）在抑制腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮作用，且與突變型p53（mutant-type p53, mtp53）存在一定的相關(guān)性。本研究利用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學染色方法檢測TIMP-3和mtp53在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）組織及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達情況，探討它們與NSCLC的轉(zhuǎn)移、組織學類型、病理分級、TNM分期和預后等方面的關(guān)系以及二者之間的相關(guān)性，為臨床預防腫瘤轉(zhuǎn)移的治療措施提供可能的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集四川大學華西醫(yī)院1998年1月-2001年12月接受根治性手術(shù)治療且保存有完整臨床資料和石蠟組織塊的NSCLC病例，按照2003年WHO肺腫瘤組織學分類的標準，對其組織學類型、病理分級、有/無轉(zhuǎn)移進行評判。共篩選出原發(fā)性NSCLC 288例，男性223例，女性65例，平均年齡59.5歲（29歲-82歲）；鱗狀細胞癌（以下簡稱為鱗癌）125例，腺癌129例，腺鱗癌34例；高分化癌27例，中分化癌112例，低分化癌115例（34例腺鱗癌無法進行分級）；伴有轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶肺癌組織150例，實際收集其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌組織106例。根據(jù)2007年肺癌國際TNM分期修訂版標準：I期98例，II期53例，III期102例，IV期35例。選取同期手術(shù)的24例良性病變（包括肺結(jié)核、囊腫、炎性假瘤及錯構(gòu)瘤）肺支氣管粘膜上皮組織作為對照。患者術(shù)前均未行放療或化療，并行術(shù)后隨訪，截止日期為2006年8月31日，中位生存時間29個月。生存期的計算從診斷日期起至隨訪日期或由于復發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡的日期為止。

1.2 組織芯片的制作 本實驗采用手工制作組織芯片。首先選擇所需病例的存檔蠟塊，根據(jù)HE染色切片進行形態(tài)學觀察，確定具有代表性的病變部位（避開出血、壞死、明顯炎細胞浸潤及纖維化區(qū)域）后在HE切片和相應(yīng)石蠟組織塊上標記。根據(jù)樣本的數(shù)量及所要求組織片的大小在空白石蠟塊（組織芯片專用）上鉆孔，此實驗選用鉆頭的直徑為1.5 mm，再用金屬空心管（內(nèi)徑仍為1.5 mm）從經(jīng)定位的目標石蠟塊上鉆取組織并轉(zhuǎn)移至已鉆孔的空白石蠟塊的相應(yīng)位置。每一個選中蠟塊（包括原發(fā)灶癌組織、轉(zhuǎn)移灶癌組織和對照組織）選3個組織芯放入芯片中（對有可能掉片的病例選4個組織芯放入芯片中）。使用病理切片機制備4 μm組織切片，置于經(jīng)防脫片處理的載玻片上，放入56oC烤箱中烘烤48 h。常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫組織化學染色 TIMP-3為兔抗人多克隆抗體（購自博士德生物技術(shù)開發(fā)有限公司），工作稀釋度為1:100，用微波枸櫞酸進行抗原修復，以胎盤絨毛作為陽性對照，采用LSAB法染色（SP法，試劑盒購自北京中山金橋生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。mtp53抗體為鼠抗人單克隆抗體（購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），工作稀釋度為1:50，用水浴EDTA進行抗原修復，以乳腺癌作為陽性對照，采用Elivision法染色（試劑盒購自Dako生物技術(shù)開發(fā)公司）。

1.4 免疫組織化學結(jié)果評定 TIMP-3以細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，mtp53以細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。將芯片內(nèi)所有癌細胞都納入計數(shù)范圍內(nèi)，將著色強度高于背景的細胞定為陽性細胞。細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)的棕黃色顆粒都分別根據(jù)陽性細胞的染色強度（未著色：0分；淡黃色：1分；棕黃色：2分；棕褐色：3分）和陽性細胞所占的構(gòu)成比評分（全陰：0分；≤10%：1分；11%-50%：2分；51%-75%：3分；＞75%：4分）；將每例獲得的兩組分數(shù)相乘：0-3分為（-）；4分-7分為（+）；8分-12分為（++）[2]。

1.5 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 13.00 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用卡方檢驗、Spearman等級相關(guān)分析、Log-rank檢驗等統(tǒng)計分析方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TIMP-3和mtp53在良性病變、NSCLC原發(fā)灶癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌中的表達情況 TIMP-3在24例肺良性病變的支氣管粘膜上皮細胞中均呈陽性表達（100%）；288例NSCLC原發(fā)灶肺癌組織中呈（-）表達42例（14.6%）、（+）表達101例（35.1%）、（++）表達145例（50.3%），其陽性表達率為85.4%；106例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌組織中呈（-）表達25例（23.6%）、（+）表達38例（35.8%）、（++）表達43例（40.6%），其陽性表達率為76.4%。原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌組織TIMP-3的表達明顯低于正常支氣管黏膜上皮組織（P＜0.01）。見圖1。

mtp53在24例肺良性病變的支氣管粘膜上皮細胞中均呈陰性表達；288例NSCLC原發(fā)灶癌組織中呈（-）表達161例（55.9%）、（+）表達54例（18.8%）、（++）表達73例（25.3%），其陽性表達率為44.1%；在106例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌組織中呈（-）表達53例（50.0%）、（+）表達27例（25.5%）、（++）表達26例（24.5%），其陽性表達率為50.0%。原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌組織mtp53的表達明顯高于正常支氣管粘膜上皮組織（P＜0.01）。見圖2。

2.2 TIMP-3和mtp53的表達與轉(zhuǎn)移的關(guān)系 不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的138例原發(fā)灶癌組織中TIMP-3呈（-）表達14例（10.1%）、（+）表達43例（31.2%）、（++）表達81例（58.7%），而伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的150例原發(fā)灶癌組織中TIMP-3呈（-）表達28例（18.6%）、（+）表達58例（38.7%）、（++）表達64例（42.7%），兩組表達差異有統(tǒng)計學意義（P=0.015）。不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的138例原發(fā)灶癌組織中mtp53呈（-）表達88例（63.8.1%）、（+）表達23例（16.7%）、（++）表達27例（19.5%），而伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的150例原發(fā)灶癌組織中mtp53呈（-）表達73例（48.6%）、（+）表達31例（20.7%）、（++）表達46例（30.7%），兩組表達差異有統(tǒng)計學意義（P=0.030）。

2.3 TIMP-3和mtp53的表達與病理學分級、組織學類型及TNM分期之間的關(guān)系 見表1。TIMP-3的表達與NSCLC的病理學分級有關(guān)，在高分化癌細胞中的表達高于中分化和低分化癌細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.030）；TIMP-3的表達與NSCLC的組織學類型和TNM分期無關(guān)（P＞0.05）。mtp53的表達與NSCLC的組織學類型和TNM分期有關(guān)（P=0.004, P=0.016），其在腺癌中的表達最低，在腺鱗癌中的表達最高，隨TNM分期的增加而增加，與NSCLC的病理學分級無關(guān)（P=0.347）。

2.4 TIMP-3和mtp53表達的相關(guān)分析 Spearman等級相關(guān)分析顯示TIMP-3與mtp53在NSCLC癌組織中的表達呈負相關(guān)（r=-0.156, P=0.008）。

2.5 TIMP-3和mtp53的表達與患者生存的關(guān)系 分析TIMP-3和mtp53在NSCLC病灶中的表達與患者的術(shù)后生存率有關(guān)：TIMP-3在病灶中呈（++）表達的NSCLC患者生存率最高，呈（-）表達者生存率最低，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9.055, P=0.011）；mtp53呈（-）表達的NSCLC患者生存率最高，呈（++）表達者生存率最低，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=11.829, P=0.003）（圖3）。

3 討論

TIMPs能特異性的抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）的活性，阻止細胞外基質(zhì)的降解，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。大量研究顯示TIMP-3的表達與腫瘤的預后有很大的相關(guān)性，Powe等[3]研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸低分化腺癌的浸潤邊緣TIMP-3的表達明顯降低，提示邊緣TIMP-3表達的降低與腫瘤浸潤有很大的關(guān)系；TIMP-3的表達降低是食管癌的浸潤增強、分期增加和預后較差的主要原因[4,5]；Span等[6]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，TIMP-3高表達的患者比低表達者預后好，Celebiler等[7]的研究結(jié)果也顯示TIMP-3的低表達促進了乳腺癌轉(zhuǎn)移；Mino等[8]研究TIMP-3在肺癌中的表達發(fā)現(xiàn)，TIMP-3的弱、中、強表達率差異在鱗癌中表現(xiàn)更為明顯，TIMP-3的低表達與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)，TIMP-3與患者的生存預后相關(guān)。這些研究結(jié)果都表明TIMP-3表達的降低會導致腫瘤更具有浸潤和轉(zhuǎn)移的能力，而Riddick等[9]在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)TIMP-3的表達與預后沒有明顯的相關(guān)性，而高表達與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)，但是在局部還是有抑制腫瘤生長的作用；Kornfeld等[10]的研究結(jié)果顯示在頭頸部的鱗狀細胞癌中TIMP-3 mRNA高表達者預后較低表達者更差。總之，TIMP-3在不同腫瘤中的作用機制還不是很一致，還需要大量的研究證明。本實驗發(fā)現(xiàn)TIMP-3在24例肺良性病變的支氣管粘膜上皮細胞中均呈100%表達，而在288例NSCLC原發(fā)灶癌組織中陽性表達已降為85.4%；且在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶癌組織中TIMP-3表達明顯低于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶。因此我們推測TIMP-3的低表達與NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這與Mino等[8]的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果中TIMP-3的表達與NSCLC的TNM分期無關(guān)，推測主要受腫瘤大小影響。本實驗還發(fā)現(xiàn)TIMP-3的表達與NSCLC的分化程度有關(guān)，NSCLC分化越好，TIMP-3的表達率越高；但TIMP-3的表達與NSCLC的組織學類型無關(guān)，這與Mino等[8]研究結(jié)果不一致，可能由于人種和地域的差異，這方面需要更進一步的研究和分析。

表1 TIMP-3和mtp53在不同非小細胞肺癌病變組織中表達差異的分析Tab 1 Analysis of expression difference of TIMP-3 and mtp53 in distinct non-small cell lung cancer (NSCLC) pathological tissues

圖1 TIMP-3在肺良性病變支氣管粘膜上皮組織（A）、鱗狀細胞癌（B）、腺癌（C）與腺鱗癌（D）中的表達（LSAB，×400 ）Fig 1 The expression of TIMP-3 in benign lesion's bronchus mucosa epithelium (A), squamous cell carcinoma (B), adenocarcinoma (C) and adenosquamous carcinoma (D) (LSAB, ×400)

圖2 mtp53在肺良性病變支氣管黏膜上皮組織（A）、鱗狀細胞癌（B）、腺癌（C）與腺鱗癌（D）中的表達（Elivision，×400）Fig 2 The expression of mtp53 in benign lesion's bronchus mucosa epithelium (A), squamous cell carcinoma (B), adenocarcinoma (C) and adenosquamous carcinoma (D) (Elivision, ×400)

圖3 TIMP-3（A）與mtp53（B）在NSCLC患者中不同表達情況的Kaplan-Meier生存曲線Fig 3 Kaplan-Meier survival curves of NSCLC patients with expression of TIMP-3 (A) and mtp53 (B)

肺癌患者p53基因突變率居人類腫瘤的首位，其基因功能的失活在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，60%的NSCLC和80%的小細胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）可檢測到p53基因的突變[11]。張霞等[12]研究表明mtp53蛋白在肺癌中表達率為51.8%，其表達率與腫瘤的分化程度有關(guān)，分化越差，表達率越高。李愛武等[13]研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC癌組織的mtp53蛋白表達（60%）較正常肺組織（5%）明顯增高，提示p53突變可能參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展過程，其中mtp53蛋白在肺腺癌組織中的表達分別高于腺鱗癌及鱗癌，原發(fā)腫瘤T3-T4組織中的mtp53蛋白表達較原發(fā)腫瘤T1-T2高，mtp53蛋白在低分化癌組織中的表達較中、高分化癌組織高，說明mtp53蛋白的表達與腫瘤的病理學類型、原發(fā)腫瘤范圍及分化程度有關(guān)。本實驗結(jié)果中mtp53在24例肺良性病變的支氣管粘膜上皮細胞中均不表達，而在288例NSCLC原發(fā)灶癌組織中陽性表達為44.1%；且在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶癌組織中mtp53表達明顯高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶；同時mtp53的表達隨NSCLC的TNM分期增加而升高。本研究中mtp53的表達在腺癌中最低，其次為鱗癌，在腺鱗癌中表達最高，因此mtp53的表達與NSCLC組織學類型的關(guān)系還有待于進一步研究。

關(guān)于TIMP-3和mtp53的相關(guān)性在肺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預后中的研究甚少。Thomas[14]和Loging等[15]發(fā)現(xiàn)mtp53具有抑制TIMP-3表達的作用，從而使受TIMP-3抑制的MMPs表達增加，達到抑制腫瘤細胞凋亡和促進腫瘤組織內(nèi)血管形成的作用，促進腫瘤的生長、浸潤與轉(zhuǎn)移。Zalcenstein等[16]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)mtp53可以通過抑制Fas啟動子的活性，下調(diào)Fas mRNA的轉(zhuǎn)錄來抑制Fas的表達，從而進一步抑制了TIMP-3通過Fas途徑誘導細胞的凋亡。本研究結(jié)果也顯示，TIMP-3與mtp53在NSCLC組織中的表達存在負相關(guān)，與文獻報道一致，但其分子機制需要進一步的研究。

綜上，TIMP-3的低表達與mtp53的高表達都可以促進NSCLC的轉(zhuǎn)移且二者之間存在抑制作用，可以考慮從增加TIMP-3的表達、降低mtp53的表達方面著手研究更好的腫瘤治療方法。臨床上也可將二者結(jié)合起來，有助于提高對NSCLC發(fā)生轉(zhuǎn)移可能性和預后等方面預測的準確性，或可能成為NSCLC患者預防腫瘤轉(zhuǎn)移的一種治療措施。