卡介苗穿梭表達質粒p MS MCP－1的構建與鑒定＊

李杜漸 徐耀庭 韋 芳 李惠民 黃汝強 許曉文 顧 煒 顧偉平

1 上海市第一人民醫院分院泌尿外科 200081； 2 上海交通大學附屬上海市第一人民醫院實驗中心

卡介苗（Bacillus Calmette－Guerin，BCG）膀胱內灌注治療表淺性膀胱移行細胞癌，是目前最成功的腫瘤免疫治療。但與此同時其顯著的毒副反應使得卡介苗在臨床上的應用受到限制。因此利用基因工程技術改造BCG菌株，以加強其免疫原性和抗瘤作用是，降低其毒副作用是大家研究的熱點。由于單核細胞趨化因子－1（MCP－1）在膀胱腫瘤免疫治

療中起到重要作用且與BCG治療效果有關。因此，本實驗利用基因工程技術在克隆BCG Ag85B和MCP－1基因的基礎上，將構建穿梭表達質粒，欲將該質粒導入BCG，使BCG表達分泌MCP－1，達到構建重組BCG的目的。

1 材料和方法

1.1 材料 Taq DNA 聚合酶、Eco RⅠ、SaⅡ、Bam HⅠ、T4DNA連接酶、DNA Marker DL2000、Marker DL15000購于上海皓嘉科技發展有限公司。BCG上海丹麥株由上海市生物制品研究所惠贈。質粒p M V261（Stover CK博士構建）由四川大學生命科學學院徐恒教授惠贈 。人MCP－1c DNA由上海交通大學附屬上海市第一人民醫院實驗中心提供。大腸桿菌DH 5α感受態細胞購于天根生化科技（北京）有限公司。PCR產物純化試劑盒購于上海華舜生物工程公司。

1.2 引物合成及聚合酶鏈反應（PCR）擴增 根據BCG抗原85B（BCG Ag85B）信號肽序列自行設計一 對引物。F5’端引入Bam HⅠ酶切位點，R：5’端引入Eco RⅠ酶切位點。F：5’GATGGA TCCAA T GACAGACGTGAGCCGAAAG3’；R：5’GTAGA A TTCCGCGCCCGCGGT TGCCGCTCC 3’。MCP－1的引物 設計，F：5’CGGA A TTCCACTCTCGCCTCCAGCA TGA AA3’，R：5’ACGCGTCGACGG GTTGTGGAGTGAGTGTTCAA3’。F：5’端引入Eco RⅠ酶切位點，R：5’端引入SaⅡ酶切位點。引物由上海皓嘉科技發展有限公司合成。PCR擴增條件為：94℃預變性3min，94℃變性45s，60℃復性1min，72℃延伸1min，共循環30次，最后72℃繼續延伸7min。PCR產物用PCR產物純化試劑盒參照產品說明書進行純化。

1.3 質粒p M V261的提取和純化 用堿裂解法提取質粒進行［1］。

1.4 重組質粒p MS的構建 將合成后的BCG Ag85B信號肽基因克隆至質粒p MV261并測序鑒定。信號肽基因及質粒p MV261分別用Bam HⅠ和EcoRⅠ酶雙酶切，p MV261酶切后加入小牛腸堿性磷酸酶1U，于37℃去磷酸化1h，經酚∶氯仿（1∶1）抽提，無水乙醇沉淀、70%乙醇洗滌后溶于TE中。然后加入10×連接緩沖液2μL、T4DNA連接酶1μL，以純水補足總體積為2μL，于16℃進行連接反應16h，構建重組質粒p MS。大腸桿菌DH5α感受態細胞的制備及連接產物的轉化按說明書進行。

1.5 陽性重組質粒p MS的篩選與鑒定 重組質粒p MS的篩選與鑒定參見文獻［2］。

1.6 MCP－1基因與上述陽性重組質粒的連接和轉化 純化后的MCP－1基因c DNA和上述陽性重組質粒p MS用Eco RⅠ和SalⅠ雙酶切后，按照4方法連接與轉化。

1.7 陽性重組質粒p MS MCP－1的篩選與鑒定按照4方法篩選由上海生工生物工程有限公司進行測序與鑒定。采用克隆位點上游的啟動子序列作為測序引物進行測序。

2 結果

2.1 重組質粒p MS的鑒定 （1）酶切鑒定：選取經電泳初步檢測比p M V261較大的質粒，將其用Bam HⅠ和Eco RⅠ雙酶切，以酶切產物為模板，用信號肽兩端引物進行PCR擴增，出現120bp左右的目的基因條帶（見圖1）。初步表明重組質粒構建成功，該重組質粒命名為p MS。（2）測序鑒定：用信號肽測序引物測序 ，由測序結果可知信號肽已經克隆到p M V261載體中 ，進一步證實了重組質粒p MS構建成功。

圖1 重組質粒酶切鑒定圖

2.2 重組質粒p MS MCP－1的鑒定 （1）酶切鑒定：選取經電泳初步檢測比p MS較大的質粒，將其用Eco RⅠ和SalⅠ雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示，質粒已完全打開，出現4 188bp和300bp兩條帶，顯示300bp的帶為插入MCP－1片斷，4 188 kb帶為質粒p MS（見圖1）。初步表明重組質粒構建成功，將其命名為p MS MCP－1。（2）測序鑒定：將p MS MCP－1陽性重組質粒進行序列分析。由上海生工生物工程有限公司進行測序，采用克隆位點上游的啟動子序列作為測序引物進行測序，兩種擴增產物的結果與理論值完全一致。由上述質粒構建過程可知，在p M V261的Bam HⅠ和Eco RⅠ酶切位點以及p MS的Eco RⅠ和SalⅠ酶切位點之間，分別插入了一約120bp和300bp的片段，而得到一新重組質粒，120bp片段為BCG Ag85B信號肽，而300bp的片段為MCP－1基因 ，進一步證實了重組質粒p MS MCP－1構建成功。

3 討論

人們對BCG治療膀胱腫瘤的局部抗瘤免疫反應的研究中發現單核細胞趨化蛋白－1（monocyte chemotactic protein－1，MCP－1）在BCG抗膀胱腫瘤過程中膀胱局部表達明顯增強。膀胱內無瘤狀態的維 持 與 MCP－1 的 水 平 表 達 關 系 密 切［3～5］。 對MCP－1前期的研究中發現MCP－1具有良好的抗膀胱 腫 瘤 作 用［6～8］。 筆 者 在 克 隆 BCG Ag85B 和MCP－1基因的基礎上 ，構建了穿梭表達質粒。下一步將通過電穿孔法把該質粒導入BCG中，使BCG分泌表達MCP－1，從而達到構建重組BCG的目的。該重組BCG可望在免疫原性及抗瘤效應方面優于BCG。其理由有以下幾點：（1）選用的穿梭表達質粒屬于染色體外質粒，轉化BCG后不會改變其染色體的結構與功能，因此不會改變BCG的減毒特性。（2）穿梭表達質粒可將 MCP－1基因轉入BCG中，使重組BCG同時具有BCG和MCP－1的雙重功能。（3）進行膀胱灌注時，重組BCG可直接接觸和刺激腫瘤組織，局部表達的較高濃度的MCP－1既可直接殺死腫瘤細胞，也能夠增強重組BCG介導的免疫應答。同時重組BCG和 MCP－1只黏附在腫瘤周圍，不進入血液循環系統，故毒副作用減少。綜上所述，通過構建了穿梭表達質粒p MS MCP－1，為下一步構建表達分泌性 MCP－1的重組BCG打下了堅實的基礎。

［1］ Sambrook KJ，Fritisch EF，Maniatis T.Molecular cloning laboratory mannual〔M〕.2nd.New York：Cold Spring Harbour Labortory Press，1989：16，322.

［2］ 夏術階，劉海濤，孫曉文，等.卡介苗穿梭表達質粒p MS腫瘤壞死因子的構建與鑒定〔J〕.中華實驗外科雜志，2005，22（3）：495－497.

［3］ Luo Y，Chen X，O’Donnell MA.Mycobacterium bovis bacillus Calmette－Guérin（BCG）induces human CC－and CXC－chemokines in vitro and in vivo〔J〕.Clin Exp Immunol，2007，147（2）：370－378.

［4］ Reale M，Intorno R，Tenaglia R，et al.Production of MCP－1 and RANTES in bladder cancer patients after bacillus Calmette－Guerin immunotherapy〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2002，51（2）：91－98.

［5］ Méndez－Samperio P，Vázquez A，Ayala H.Infection of human monocytes with Mycobacterium bovis BCG induces production of CC－chemokines〔J〕.J Infect，2003，47（2）：139－147.

［6］ 李杜漸，楊宇如，魏強，等.單核細胞趨化蛋白－1對膀胱腫瘤荷瘤裸鼠的作用〔J〕.華西醫學，2003，18（4）：536－537.

［7］ 李杜漸，陳一戎，王志平，等.單核細胞趨化蛋白－1對膀胱腫瘤浸潤淋巴細胞增殖的作用〔J〕.現代泌尿外科，2004，9（3）：137－139.

［8］ 李杜漸，楊宇如，李響，等.單核細胞趨化因子及鐘聲蛋白樣受體在卡介苗灌注膀胱局部抗腫瘤免疫反應中的表達〔J〕.臨床泌尿外科雜志，2006，21（11）：859－862.