G－CSF對大鼠腦出血后腦水腫及基質金屬蛋白酶－9的影響

何曉英 付 華 袁 平 譚 華 李小剛

瀘州醫學院附屬醫院 1 神經內科 2 乳腺外科，四川省瀘州市 646000

粒細胞集落刺激因子（granulocyte colonystimulating factor，G－CSF）是細胞因子家族中的一員，國內外研究證實G－CSF在缺血性腦血管病中通過促進神經網絡重構、血管再生、抗炎等作用減輕腦損害。G－CSF對ICH是否也有神經保護作用國內外鮮見報道，本研究利用動物模型研究G－CSF對ICH后腦水腫的影響及可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物：雄性SD大鼠，SPF級，體重250～320g，144只，由瀘州醫學院動物中心提供。

1.1.2 藥物與試劑：人重組粒細胞集落刺激因子注射液（rh G－CSF，商品名瑞血新），購自深圳新鵬生物工程有限公司；M MP－9單克隆抗體，購自Santa Cruz公司（兔抗鼠）；二抗（羊抗兔Ig G）、SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器：WDT－V型鼠腦立體定向儀（西安西北光電儀器廠）；萬分之一克電子分析天平（德國Sartorius公司生產）；電熱恒溫烤箱（上海科析實驗儀器廠）；通用手術器械；50μL微量進樣器。

1.2 方法

1.2.1 分組與用藥：大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組、治療組，各組均為48只。每組根據取材時間點又分為6h、12h、24h、48h、72h、7d組，每組8只。用藥：治療組于造模1h后腹腔注射rh G－CSF 60μg／kg，假手術組、模型組僅經注射點注入等容積的生理鹽水。3組動物于術后6h、12h、24h、48h、72h、7d時間點被處死。

1.2.2 ICH 模型制備：參照 Yang［1］的方法制備ICH模型。大鼠稱重后予2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（50mg／kg），待完全麻醉后，俯臥固定于鼠腦立體定位儀上。常規頭皮消毒，沿頭皮正中切開一長約10mm縱切口，切開骨膜，鈍性分離暴露前囟，調整立體定位儀，將微量注射儀尖端定位于前囟前0.5mm，中線右側旁開3mm處，用微型手鉆在此處鉆一直徑0.5mm的小孔。采用斷尾取自體血法取鼠尾不凝血50μL，沿所鉆小孔進針6mm（相當于大鼠殼尾核部位），以10μL／min速度緩慢勻速注入殼尾核，注血結束后留針15min，緩慢退針（30s），縫合頭皮。假手術組以生理鹽水50μL代替自體血，余操作同上。手術過程嚴格無菌操作。術后動物單籠飼養，自由飲水和進食，整個實驗過程保持室溫26℃。

1.2.3 干濕重法測定腦組織含水量：3組動物于術后6h、12h、24h、48h、72h、7d（n＝4）處死，開顱取出腦組織，去除腦膜、低位腦干和小腦，置于稱重杯中用電子天平稱取濕重，后置于電熱恒溫烤箱內100℃烘烤24h，至恒重后稱干重（兩次干重之差≤0.2mg）。按Elliott公式計算：腦組織含水量（%）＝（濕重－干重）／濕重×100%。

1.2.4 M MP－9免疫組化檢測及陽性細胞計數：3組動物于術后6h、12h、24h、48h、72h、7d（n＝4）采用4%多聚甲醛內固定后斷頭取腦，多聚甲醛外固定，軟石蠟包埋制成蠟塊，自動切片機連續切片，片厚5μm，用于免疫組化檢測。M MP－9免疫組化按ABC試劑盒說明書進行。各組于相應時間點每只大鼠每個指標選一張腦切片，在400倍光鏡下隨機選擇血腫周圍4個互不重疊的視野，每個時點共計16個視野，胞漿棕黃色者為陽性細胞。用IPP（image－p roplus 6.0）醫學圖像分析軟件計數每個視野該指標的陽性細胞數，取均數為各時點該指標陽性細胞數。

1.4 統計方法 應用SPSS11.5軟件進行統計處理。結果以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One－Way ANOVA）的最小顯著差法（LSD），兩樣本均數比較采用t檢驗。顯著性水準取α＝0.05。

2 結果

2.1 腦組織含水量動態觀察 模型組腦組織含水量顯著高于假手術組（P＜0.05），在48h、72h最明顯，且與6h、12h、24h、7d相比有差異（P＜0.05），提示ICH后腦組織含水量增加，48～72h達高峰。治療組腦組織含水量明顯低于模型組（P＜0.05），提示CSF能減輕ICH大鼠腦水腫程度。見表1。

表1 各組不同時間點腦組織含水量變化（±s，%）

表1 各組不同時間點腦組織含水量變化（±s，%）

注：與假手術組比較＃P＜0.05；與模型組6h、12h、24h、7d比較▲P＜0.05；與模型組比較■P＜0.05。

7d假手術組 77.80±0.483 77.91±0.830 77.54±0.621 77.28±0.532 77.55±0.260組別 6h 12h 24h 48h 72h 78.02±0.571模型組 80.10±0.180＃ 81.30±0.602＃ 82.47±0.101＃ 84.15±0.581＃▲ 84.10±0.510＃▲ 80.39±0.393＃治療組 78.03±0.112■ 78.60±0.518■ 79.02±0.910■ 80.87±0.251■ 79.73±0.272■ 78.12±0.384■

2.2 M MP－9表達的測定 模型組 M MP－9的表達明顯高于假手術組（P＜0.05），模型組 M MP－9在48h、72h最明顯，且與6h、12h、24h、7d相比有差異（P＜0.05），提示ICH 后 M MP－9表達增強，48～72h達高峰。治療組各時間點 M MP－9的表達低于模型組（P＜0.05），提示 G－CSF能抑制ICH 后M MP－9的表達。見表2。

表2 各組不同時間點血腫周圍MMP－9表達（±s）

表2 各組不同時間點血腫周圍MMP－9表達（±s）

注：與假手術組比較＃P＜0.05；與模型組6h、12h、24h、7d比較▲P＜0.05；與模型組比較■P＜0.05。

7d假手術組 1.35±0.88 1.50±0.87 1.45±0.83 1.65±0.82 1.60±0.74組別 6h 12h 24h 48h 72h 1.55±0.81模型組 6.35±0.87＃ 7.32±0.10＃ 8.20±0.85＃ 10.35±0.60＃▲ 10.55±0.82＃▲ 3.70±0.38＃治療組 3.32±0.20■ 4.01±0.43■ 5.54±0.11■ 6.83±0.25■ 6.80±0.45■ 2.85±0.01■

3 討論

G－CSF作為細胞生長因子家族中的一員，是骨髓造血干細胞強有力的動員劑，己廣泛應用于血液系統疾病如中性粒細胞減少癥、骨髓移植等。近年來G－CSF動員骨髓干細胞治療急性心肌梗死的動物實驗和臨床研究己初顯成效［2］，同時也有越來越多的研究結果顯示G－CSF在中樞神經系統有更重要的非造血功能，因此G－CSF在神經系統的作用逐漸受到關注。研究證明G－CSF的生物學作用是通過與效應細胞表面特異性受體G－CSF－R結合而產生的，G－CSF－R在中樞神經系統也有表達，這暗示G－CSF可通過受體介導的內攝作用而通過完整的血腦屏障［3］。動物模型實驗性變態反應性腦炎（EAE）中已證實G－CSF有抗炎作用；動物實驗及部分臨床數據表明G－CSF通過減小腦梗死體積、抗炎、抗凋亡、促進梗死區新的神經和血管的形成、促進神經祖細 胞 分 化 等 多 種 途 徑 起 到 神 經 保 護 作 用［4，5］。Sevimli［6］等利用基因沉默技術比較了內源性G－CSF缺乏及G－CSF替代治療的腦缺血大鼠，發現后者梗死病灶大小較前者顯著縮小、神經功能恢復情況明顯優于前者，進一步證實了G－CSF參與了腦損害后神經恢復機制。

G－CSF在ICH中的作用目前尚處于起步階段。Park等［7］觀察到在ICH模型中G－CSF能減少腦水腫范圍、減低血腦屏障通透性、減輕炎癥、減少血腫周圍死亡細胞。張磊等［8］在實驗中也觀察到經GCSF治療后出血灶所在的大腦半球神經細胞凋亡數量明顯減少。本實驗采用斷尾取自體血方法制備ICH模型，研究顯示ICH組腦組織含水量與對照組間差別有顯著性意義，48～72h達高峰，至第7天逐漸恢復，與國內外報道的ICH后腦水腫規律一致。同時在研究中發現治療組各時間點腦組織含水量明顯輕于模型組（P＜0.05），提示 G－CSF能減輕ICH后腦水腫程度。

上述結果顯示ICH后，G－CSF通過減輕腦水腫程度發揮神經保護作用，由此筆者進一步研究了其作用的可能機制。已知腦水腫是ICH最為嚴重的繼發性損傷，它的產生和發展是導致ICH病情發展和惡化的重要原因之一。ICH后腦水腫的發生發展受諸多因素影響，如：血腫成分及分解產物、炎性細胞因子、補體系統、M MP、AQP等，其中 M MP－9對腦水腫的影響備受關注。M MP－9是ICH后腦組織主要表達的細胞外基質蛋白酶，它可以結合基底膜的大分子物質并破壞明膠，主要攻擊腦血管周圍基膜的主要成分，破壞血腦屏障，從而引起其通透性升高，導 致 腦 水 腫。Gursoy－ozde 等［9］運 用 敲 除 了M MP－9基因的遺傳工程小鼠，證實了M MP－9可以破壞BBB和加快腦水腫形成。動物實驗表明［10］ICH后血腫周圍M MP－9陽性細胞表達和腦組織含水量表達趨勢相同。臨床患者核磁共振研究進一步證實患者腦水腫的變化規律與血清M MP－9表達變化過程一致［11］。本實驗結果也顯示ICH組從6h開始M MP－9陽性細胞表達增多，48～72h達高峰，到7d還有表達，ICH組各時間點的表達與假手術組比較有顯著統計學差異，且實驗中也觀察到在模型組中M MP－9的表達趨勢同腦組織含水量的變化規律一致。治療組各時間M MP－9表達明顯輕于模型組，有統計學差異，提示G－CSF抑制了M MP－9的表達。由此推測G－CSF減輕治療組腦水腫的機理可能與G－CSF下調 M MP－9的表達有關。本實驗結果與Sevimli［12］最近報道 G－CSF發揮腦保護作用的重要機制之一是通過下調中風后腦組織周圍M MP－9表達相一致。G－CSF下調ICH后M MP－9表達減輕腦水腫機理推測可能是：G－CSF具有抗炎、抑制炎性細胞浸潤作用［13］，而 M MP－9主要由炎性細胞如T細胞、中性粒細胞和巨噬細胞等炎性細胞分泌，因此ICH后G－CSF通過抑制炎性因子表達下調M MP－9基因啟動子，從而發揮減輕腦水腫程度的作用。

綜上，G－CSF具有抑制ICH周圍組織 M MP－9的表達、減輕ICH后腦水腫的作用，其確切作用機制還有待進一步的實驗研究。

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