穿心蓮內酯對人鼻咽癌細胞增殖以及Na+-K+-ATP酶活性的影響

王柏琦 程愛蘭

穿心蓮內酯對人鼻咽癌細胞增殖以及Na+-K+-ATP酶活性的影響

王柏琦 程愛蘭

目的 觀察穿心蓮內酯(Andrographolide, AD)對人鼻咽癌CNE-2細胞的生長抑制作用，并研究其對凋亡的作用機制。方法 體外培養CNE-2細胞，分別用1.0mmol/L、3.0mmol/L、5.5μmol/L的AD處理細胞24h、48h、72h。CCK-8法檢測細胞的增殖抑制率；流式細胞術分析細胞周期的變化；無機磷法檢測Na+-K+-ATP酶活性改變。結果 AD能顯著抑制CNE-2細胞的增殖，使其細胞周期停滯于S期和G2/M期；不同濃度的AD能降低Na+-K+-ATP酶活性且呈劑量依賴性，即當AD濃度為1.0μmol/L時，能使酶活性降低至83%，3.0μmol/L時其活性降為63.3%，而5.5μmol/L AD能使Na+-K+-ATP酶活性降低至42%。結論 AD對鼻咽癌細胞增殖具有一定的抑制作用，有望成為一種潛在的腫瘤治療藥物。

穿心蓮內酯；鼻咽癌細胞；增殖抑制；腫瘤治療藥物

人類鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國較為常見的頭頸部惡性腫瘤之一。其發生跟其他腫瘤類似，也是一個多因素、多步驟、多階段的復雜過程，涉及到宿主體內的基因型以及表型的變化[1-2]。NPC早期多無明顯臨床癥狀，往往就診時已到中晚期，且大多患者因發生轉移而失去手術的最佳時機。因此，了解NPC的作用機制并尋求有效的抗癌藥物是當務之急。

目前，學者們把抗癌藥物治療策略轉向抑制腫瘤侵襲生長過程中的特異性分子和通路的分子靶向治療。在癌癥的發生中，Na+-K+-ATP酶誘導細胞黏附及信號轉導的作用不可忽視，目前認為，其表達及活性與癌癥的發生發展密切相關，已成為當前抗癌藥物的一個重要靶標。

眾所周知，穿心蓮內酯(And rographolide, AD) 是從我國傳統中草藥穿心蓮中提取出來的一類二萜類化合物，常用于消炎解毒等方面的治療，臨床上常用于治療各種感染性疾病[3]。最近研究表明，AD不僅有抗炎作用，而且具有抗腫瘤的潛能[4]。但是有關AD在NPC中的作用尚不清楚。本研究意在探討AD對鼻咽癌細胞增殖有無影響，并從Na+-K+-ATP酶活性方面探討其在NPC中的治療價值。

1 資料和方法

1.1 細胞和主要試劑 鼻咽癌CNE-2細胞由中南大學湘雅醫學院腫瘤所惠贈；穿心蓮內酯（A nd ro）購自Sigm a-A ld rich公司，并用二甲基亞砜溶解使其成為濃度為15mmol/L的貯存液。胎牛血清、RPM I-1640培養基、抗生素均購于美國Invitrogen。其他試劑均購于上海生工。

1.2 細胞培養與處理 人鼻咽癌細胞系CNE-2用含10%胎牛血清的RPM I-1640培養基（pH 7.2）在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下進行傳代培養。實驗細胞密度調整為108/L，分為陰性對照組和AD處理組。其中對照組加入等量的RPM I-1640培養基，處理組加入1.0mm ol/L、3.0mm ol/L、5.5μm ol/L的AD，在37℃下分別處理細胞24h、48h、72h。

1.3 CCK-8檢測鼻咽癌細胞增殖實驗 取長勢良好的CNE-2細胞，調整細胞濃度為5×104/m L后接種于96孔板中（每孔100uL），每組設立5個復孔，孵育24h。待細胞貼壁后，加入不同濃度的AD孵育24～72h。細胞處理結束后，加入10μL CCK-8溶液（注意避免產生氣泡），37℃繼續培養1～4h。用酶標儀測定其在450nm處的吸光度。細胞抑制率為：空白組OD值-處理組OD值/空白組OD值×100%。

1.4 FCM法檢測CNE-2細胞周期 采用AD處理過的CNE-2細胞（約1×106個），實驗組和對照組均加入75%的乙醇1.5m L，4℃固定過夜。上機前處理：將固定后的CNE-2細胞用低溫離心機離心，條件為1000rpm 5m in，丟棄上清，再用PBS洗滌2～3次。最后用200μL的預冷的PBS重懸浮CNE-2細胞，最后加入PI染液0.5m L并避光染色30m in。染色完后用200目尼龍網過濾，用FCM檢測細胞核中PI熒光強度，檢測條件：波長為488nm，變異系數<2%，并通過專業軟件確定不同時間點的細胞比例。

1.5 Na+-K+-ATP酶活性分析 通過測定酶促反應釋放的無機磷（Pi）的含量多少來確定ATP酶的活性改變情況。其反應體系包括20mm ol/L KC l、100mmol/L NaC l、30mm ol/L T ris-HC l緩沖液（pH 7.4）、2mmol/L ATP以及新鮮細胞線粒體分離物。反應體系加入ATP后，30℃孵育15m in，接著加入15%三氯乙酸終止反應。通過測量640nm處的吸光度分析釋放的無機磷的含量。ATP酶活性的定義為1m g蛋白質1h內催化ATP生成1μmol/L 無機磷的量為1個單位ATP酶活性。

1.6 統計學方法 所有數據采用SPSS13.0統計學軟件進行處理，以上實驗所得到的計量資料數據均用（）表示，重復3次，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 AD對CNE-2細胞增殖影響 本研究采用CCK-8法檢測AD對CNE-2細胞的體外生長呈時間-劑量依賴性。從表1可以看出，濃度分別為0、1mm ol/L.0、3.0mm ol/L、5.5μm ol/L的AD體外能顯著抑制CNE-2細胞。不同濃度AD在同一的時間點對CNE-2抑制率劑量增加而遞增。而同一藥物濃度隨作用時間的延長其抑制率也明顯增強。經統計學分析，差異顯著（P<0.05）。

2.2 AD對CNE-2細胞周期的影響 0、1.0mm o l/L、3.0mmol/L、5.5μmol/L的AD作用CNE-2細胞72h后，AD處理組相對于對照組，不同濃度的AD能使CNE-2細胞的G0/G1期細胞比例隨AD濃度增加而減少（P<0.05），而S期細胞和G2/M期比例增高反而升高（P<0.05），詳見表2。

2.3 不同濃度AD對Na+-K+-ATP酶活性的影響 不同濃度的AD能不同程度抑制CNE-2細胞Na+-K+-ATP酶活性。其中AD濃度為1.0μmol/L時，能使酶活性降低至83%，3.0μmol/L時其活性為63.3%，而5.5μmol/L AD能使Na+-K+-ATP酶活性降低至42%，見圖3所示。

表1 不同濃度AD在不同作用時間下對CNE-2細胞增值的抑制率

表2 不同濃度AD作用CNE-2細胞72h后對其細胞周期影響分布

圖3 不同濃度AD對CNE-2細胞Na+-K+-ATP酶活性的影響aP<0.05 VS 對照組

3 討論

鼻咽癌患者發病早期通常選擇放射治療，但總體效果欠佳，原因是不僅鼻咽癌的復發率較高，且患者就診時大多已經到了中晚期。為了選擇更為有效的治療方法，人們堅持不懈地嘗試各種方法，包括基因治療、免疫治療以及化療等[5-7]。但現有的治療手段以及抗癌藥物仍然得不到比較滿意的結果，因此尋求新的藥物是當務之急。

本研究中，我們的研究證實AD能顯著抑制鼻咽癌CNE-2細胞的生長，呈劑量和時間依賴性及使其阻滯于細胞生長周期的S期和G2/M期，并能有效地降低Na+-K+-ATP酶活性。這些研究結果表明AD可能是一種有效延緩鼻咽癌進展的潛在性藥物，其作用機制可能是降低Na+-K+-ATP酶活性，減少細胞間黏附及信號轉導實現的。Na+-K+-ATP酶為三羧酸循環的關鍵酶，由兩個亞單位組成，即1個α-亞單位和1個β亞單位組成的異源二聚體。其中α-亞單位是一種跨膜蛋白，可促進細胞外K+和細胞內Na+之間交換[8-9]，所以該酶可調節體內外離子間的動態平衡。一般認為引起Na+-K+-ATP酶活性發生改變各種因素，均可引起線粒體跨膜勢能的改變，因而導致細胞凋亡及釋放凋亡相關分子[10-11]。在本研究中，AD的確能引起Na+-K+-ATP酶活性降低，表明AD引起鼻咽癌細胞中Na+-K+-ATP酶的α-亞單位功能發生了改變或破壞了線粒體膜的功能，表明線粒體功能障礙可能是AD誘導鼻咽癌細胞凋亡的最終結局[12]。

綜上所述，AD能顯著抑制CNE-2細胞的增殖并能降低Na+-K+-ATP酶活性，從而引起CNE-2細胞凋亡。這表明AD可能是一種潛在的抗癌藥物。但作為一種新的抗癌治療藥物，對鼻咽癌細胞種類以及癌癥的分期的不同可能療效不同，并且其在體內研究的有效性及安全性尚需進一步研究。

[1] 蘭桂萍,林輝,廖建,等.2007～2008年廣西蒼梧縣石橋鎮鼻咽癌普查結果初步分析[J].中國腫瘤臨床,2010,37⑽:576-578.

[2] 羅偉仁,陳小毅,蔡瓊珍,等.COX-2和E-鈣黏素在鼻咽癌組織中的表達及其相互關系[J].臨床耳鼻咽喉科雜志,2006,20(17):800-802.

[3] Lee KC, Chang HH, Chung YH, et al. Andrographolide acts as an anti-inflammatory agent in LPS-stimulated RAW264.7macrophages by inhibiting STAT3-mediated suppression of the NF-kappaB pathway[J]. J Ethnopharmacol, 2011,135⑶:678-684

[4] Pratheeshkumar P, Kuttan G. Andrographolide inhibits human umbilical vein endothelial cell invasion andmigration by regulating MMP-2 and MMP-9 during angiogenesis[J].J Environ Pathol Toxicol Oncol, 2011,30⑴:33-41

[5] Arango BA, Castrellon AB, Perez CA, et al. Nasopharyngeal carcinoma: alternative treatment options after disease progression[J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2010,10⑶:377-386.

[6] De Paoli P. Novel virally targeted therapies of EBV-associated tumors[J]. Curr Cancer Drug Targets, 2008,8⑺:591-596.

[7] 邱壽慶,唐錕.局部晚期鼻咽癌同期放化療的療效觀察[J].當代醫學,2012,18(12):52.

[8] Chung C, Mader CC, Schmitz JC, et al. The vacuolar-ATPase modulates matrix metalloproteinase isoforms in humanpancreatic cancer[J]. Lab Invest, 2011,91⑸:732-743

[9] Garcia-Garcia A, Perez-Sayans GM, Rodriguez MJ, et al. Immunohistochemical localization of C1 subunit of V-ATPase (ATPase C1) in oralsquamous cell cancer and normal oral mucosa[J]. Biotech Histochem, 2012,87⑵:133-139

[10] Rajasekaran SA, Huynh TP, Wolle DG, et al. Na,K-ATPase subunits as markers for epithelial-mesenchymal transition in cancerand fibrosis[J]. Mol Cancer Ther, 2010,9⑹:1515-1524

[11] Sanchez-Cenizo L, Formentini L, Aldea M, et al. Up-regulation of the ATPase inhibitory factor 1 (IF1) of the mitochondrial H+-ATPsynthase in human tumors mediates the metabolic shift of cancer cells to aWarburg phenotype[J]. J Biol Chem, 2010,285(33):25308-25313

[12] Huang KH, Chow KC, Chang HW, et al. ATPase family AAA domain containing 3A is an anti-apoptotic factor and asecretion regulator of PSA in prostate cancer[J]. Int J Mol Med, 2011,28⑴:9-15

book=27,ebook=90

10.3969/j.issn.1009-4393.2012.26.017

421001 南華大學腫瘤研究所 （王柏琦 程愛蘭） 421001南華大學附屬第二醫院腫瘤內科（王柏琦）