七氟醚預處理對LPS誘導的小鼠心功能障礙的影響*

李健玲， 朱小青， 李學敏， 李紅梅， 王彥平， 王 媛， 戚仁斌△， 李雅蘭△

(暨南大學1附屬第一醫院麻醉科，2醫學院病理生理學系，國家中醫藥管理局病理生理實驗室，廣東廣州 510632)

七氟醚預處理對LPS誘導的小鼠心功能障礙的影響*

李健玲1， 朱小青2， 李學敏2， 李紅梅2， 王彥平2， 王 媛2， 戚仁斌2△， 李雅蘭1△

(暨南大學1附屬第一醫院麻醉科，2醫學院病理生理學系，國家中醫藥管理局病理生理實驗室，廣東廣州 510632)

目的:觀察七氟醚(Sevo)預處理對脂多糖(LPS)誘導的心功能障礙的影響并初步探討其作用機制。方法:40只雄性BALB/c小鼠隨機分為4組:對照組(control)、LPS組、Sevo組和Sevo+LPS組。分別用2% Sevo(以純氧為載氣)或純氧預處理30 min，洗脫10 min后，腹腔注射LPS 18 mg/kg或等量生理鹽水。于腹腔注射后12 h，通過高分辨小動物超聲系統檢測心功能，結束后立即采血并處死小鼠，用生化分析儀檢測血清乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK－MB)活性;留取小鼠心臟標本，制備石蠟切片，進行HE染色后在光學顯微鏡上觀察各組小鼠心臟的組織結構變化，分別用硝酸還原酶法和比色法檢測小鼠心肌組織中一氧化氮(NO)的含量和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的活性。結果:LPS腹腔注射后12 h，超聲檢測顯示LPS組小鼠左心室舒張末期容積(LVEDV)增大(P＜0.05)，每搏輸出量(SV)、心輸出量(CO)和射血分數(EF)降低(P＜0.05);血清LDH和CKMB水平升高(P＜0.05);病理切片見心肌明顯病變。Sevo+LPS組與LPS組比較，LVEDV減小(P＜0.05)，SV、CO和EF增加(P＜0.05)，LDH和CK－MB水平顯著降低(P＜0.05)，心肌組織的病理損傷減輕。LPS引起心肌組織中NO含量和iNOS活性升高(P＜0.05)，Sevo對此有抑制作用(P＜0.05)。結論:Sevo預處理減輕LPS引起的心肌損傷和心功能障礙，其機制可能與其抑制心肌iNOS活性，減少NO的生成有關。

七氟醚;預處理;脂多糖類;心肌保護;一氧化氮合酶;一氧化氮

臨床上約有25%～30% 的膿毒癥是由G－菌感染引起的，其細胞壁的主要成分內毒素(endotoxin)或脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)，由脂質A、核心寡糖和O－特異性側鏈組成，是膿毒癥性休克的主要致病因子［1］。心功能障礙是膿毒癥休克患者常見的并發癥之一，有報道稱心功能障礙的發生，特別是內毒素引起的，可使膿毒癥休克的死亡率從20%增加到70%～90%［2］。因此，改善心臟功能對于膿毒癥病人的生存具有重要作用。

嚴重創傷合并感染的患者(如膿毒癥)往往需要手術治療，所以麻醉劑的選擇對病人的術中安全和預后康復有重要的影響。美國心臟病學會2007年發布的指南中推薦使用鹵族類吸入麻醉藥以保護心肌［3］，七氟醚(sevoflurane，Sevo)是90年代上市的一種新型吸入麻醉劑，具有誘導和蘇醒迅速、術中維持平穩等優點，目前在臨床上應用廣泛［4］。已有大量的臨床研究證實，七氟醚對缺血的心肌有保護作用，如De Hert等［5］研究發現冠狀動脈搭橋術(coronary artery bypass grafting，CABG)中使用七氟醚，可使術后循環更穩定。我們先前研究［6］采用手術結扎大鼠左冠狀動脈前降支模型，也證實七氟醚在缺血再灌注損傷中具有心肌保護作用。然而，七氟醚對內毒素損傷的心肌是否也具有保護作用?如果有保護作用，是否與在心血管調節中有重要作用的一氧化氮(nitric oxide，NO)系統有關?目前則鮮見報道。因此，本實驗擬采用小鼠LPS腹腔注射復制內毒素血癥模型，觀察七氟醚預處理對內毒素誘導的心功能障礙的影響，并對其與NO及誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的關系作初步探討。

材料和方法

1 材料

LPS(大腸桿菌O55∶B5)購自Sigma，Sevo購自Abbott，NO檢測試劑盒(硝酸還原酶法)、iNOS檢測試劑盒(比色法)購自南京建成生物工程研究所，蛋白定量測定試劑盒(BCA法)購自上海申能博彩生物公司;主要實驗儀器包括 WATO Ex－20呼吸機(Mindray，中國)，Bx40型光學顯微鏡(Olympus)，VisualSonies?Vevo770TM高分辨小動物超聲系統(Visual Sonics)，7600－020型全自動生化分析儀(Hitachi)，Tecan safire全波長多功能酶標儀(Tecan)。

2 方法

2.1 實驗分組 SPF級雄性BALB/c小鼠40只，6～8周齡，體重23～25 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2008－0002，自然晝夜周期和自由飲水進食條件下分籠飼養。實驗前置于實驗環境中適應1周，實驗環境溫度控制在(24± 2)℃，相對濕度為60%～80%。所有小鼠隨機分為4組:對照組(control)、LPS組、Sevo組和七氟醚處理組(Sevo+LPS)。LPS組和control組給予100%純氧30 min，洗脫10 min，分別腹腔注射18 mg/kg LPS(0.2 mL/10 g)和等量生理鹽水(0.2 mL/10 g);Sevo+ LPS組和Sevo組用100%純氧作為載氣給予2%七氟醚預處理30 min，洗脫10 min，分別腹腔注射LPS和生理鹽水。

2.2 心功能的檢測 于腹腔注射后12 h，小鼠稱重，用0.67%戊巴比妥鈉(0.1 mL/10 g)腹腔注射麻醉，使小鼠保持適當的麻醉狀態，保持自主呼吸，放置于37℃的恒溫墊上，通過導電膏將小鼠四肢末端與4個電極相連接并用膠布固定。在小鼠胸前區涂抹超聲偶合劑，運用RMV707B型高頻超聲探頭(探頭頻率設置為30 MHz，探測深度為10～15 mm)對小鼠進行超聲心動圖檢查，探頭置于其左胸，實時采集胸骨旁左心室短軸M型超聲心動圖像。連續采集10個心動周期的動態圖像，記錄的M超的掃描速度為800 mm/s，儲存圖像后進行脫機分析。利用VisualSonies?Vevo770TM高分辨率小動物超聲系統軟件，在所采集圖像上對數據進行處理和分析，測得各組小鼠心率(heart rate，HR)、每搏輸出量(stroke volume，SV)、心輸出量(cardiac output，CO)、左心室舒張末期容積(left ventricular end－diastolic volume，LVEDV)和射血分數(ejection fraction，EF)。所有數據及計算值均根據美國超聲心動圖協會(ASE)推薦方法，每組原始數據取連續3個心動周期的平均值，超聲檢查的操作及分析均由專業人員完成。

2.3 血清心肌酶的測定 各組小鼠于超聲心功能檢測完畢后，立即去眼球取血0.8 mL，室溫靜置2 h，5 000 r/min離心15 min，取上清，全自動生化儀測定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和肌酸激酶同工酶(creatine kinase－MB，CK－MB)含量。

2.4 HE染色觀察心肌組織結構 各組小鼠采血后立即處死，打開胸腔，分離心臟，取心尖部組織，迅速置入4%甲醛溶液中固定，常規方法制成石蠟切片，HE染色，在光學顯微鏡下觀察心臟組織結構的改變，并拍攝照片。由同一個實驗者在光鏡下觀察組織學特征后給出病理報告。

2.5 心肌組織NO含量及iNOS活性的測定 冷生理鹽水浸洗并輕微擠壓心臟，將心腔殘留的血液排出，然后用濾紙吸干液體。將心臟置于勻漿器中，以1∶10質量體積比加入生理鹽水，在冰面上充分勻漿，所得勻漿液4℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清分裝，－20℃保存，BCA法測定心肌組織勻漿蛋白含量。然后，按試劑盒說明書的操作步驟采用硝酸還原酶法檢測其NO含量(μmol/g protein)，進一步采用比色法檢測iNOS活性(U/g protein)。

3 統計學處理

用SPSS 17.0統計軟件分析。計量資料采用均數±標準誤(珋x±sE)表示，多組間比較用單因素方差分析(One－way ANOVA)，各組方差齊時，兩兩比較采用LSD法;各組方差不齊時，兩兩比較用Tamhane＇s T2法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 心功能檢測結果

各組小鼠HR無顯著差異。與對照組相比，LPS組小鼠LVEDV增大(P＜0.05)，SV、CO和EF顯著降低(P＜0.05)。而Sevo+LPS組與LPS組比較，LVEDV減小(P＜0.05)，SV、CO和EF增加(P＜0.05)，見圖1、表1，提示七氟醚預處理可使心功能在一定程度上得到改善。

2 血清心肌酶的檢測結果

表2顯示，對照組與Sevo組之間血清LDH和CK－MB水平無顯著差異(P＞0.05);LPS腹腔注射后12 h，小鼠血清LDH和CK－MB含量顯著高于對照組(P＜0.05);而Sevo+LPS組與LPS組相比，LDH和CK－MB含量顯著下降(P＜0.05)。

Figure 1. Representative M－mode echocardiograms at the papillary muscle level obtained from the mice in various group.圖1 各組小鼠乳頭肌水平M型超聲心動圖

表1 各組小鼠心功能Table 1.The cardiac functions of the mice in various groups(x珋±s.n=10)

表2 各組小鼠血清LDH和CK－MB水平Table 2.Serum levels of LDH and CK－MB in various groups (U/L.珋x±s.n=10)

3 心肌組織病理變化

LPS或生理鹽水腹腔注射后12 h，光鏡下觀察結果見圖2。對照組和Sevo組心肌纖維組織排列致密整齊、細胞結構正常、核清晰，細胞間隙內無滲出和炎癥細胞浸潤;LPS組心肌纖維組織排列稀疏紊亂，細胞結構模糊，且細胞間隙內有明顯的滲出，紅細胞和白細胞浸潤;而Sevo+LPS組心肌纖維組織排列較為整齊，細胞結構較為清晰，細胞間隙內無明顯的滲出，炎癥細胞浸潤相對減少。

4 心肌NO含量和iNOS活性

圖3顯示，對照組和Sevo組之間心肌NO含量無顯著差異(P＞0.05)，在LPS腹腔注射后12 h，心肌NO含量顯著增加(P＜0.05)，七氟醚預處理組小鼠心肌組織中 NO含量較 LPS組顯著降低(P＜0.05)。圖4顯示，LPS組心肌iNOS活性顯著高于對照組(P＜0.05);七氟醚預處理組與LPS組相比，iNOS活性則顯著降低(P＜0.05)。

Figure 2. Representative HE sections of hearts from the mice 12 h after LPS or normal saline injection.圖2 LPS或生理鹽水注射后12 h各組小鼠心肌HE染色

Figure 3. Myocardial NO content in various groups.珋x±s.n= 10.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LPS group.圖3 各組小鼠心肌組織NO含量

Figure 4. Myocardial iNOS activity in various groups.珋x±s.n= 10.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LPS group.圖4 各組小鼠心肌組織iNOS活性

討論

本研究沿用本實驗室已經建立的成熟和穩定動物模型［7］，即采用BALB/c小鼠腹腔注射LPS(18 mg/kg)復制內毒素血癥動物模型，而后從心功能、心功酶學、心肌形態等方面評價七氟醚(Sevo)預處理對內毒素血癥小鼠心功能障礙的影響。實驗采用小動物超聲檢測儀對小鼠心功能進行了無創檢測和評價，其結果顯示LPS處理后12 h的小鼠心功能有明顯變化:左心室的SV、CO、EF顯著降低、LVEDV增大，提示LPS攻擊后的小鼠左心室射血功能有所降低，導致LVEDV增大。這一結果與Li等［8］的研究有相似之處。他們還認為在LPS的研究中選擇與前后負荷相關的指標可以避免得出不恰當的結論。故本實驗結果究其原因可能與LPS損傷血管內皮細胞，增加外周循環阻力;心臟長時間代償最終導致失代償，進而導致心功能降低，心臟不能有效泵血，導致血液潴留，進而引起LVEDV升高。而Sevo預處理組左室的SV和CO較正常組雖有所降低，但較LPS組EF有所改善且LVEDV(前負荷)減小，提示Sevo預處理可在一定程度上改善心功能，減輕LPS所導致的心功能障礙。此外，LPS處理后12 h的病理結果顯示:心肌纖維組織排列稀疏紊亂，細胞結構模糊，且細胞間隙內有明顯的滲出，紅細胞和白細胞浸潤，提示在LPS的攻擊下心肌細胞存在損傷和炎癥反應;而Sevo預處理組的心肌纖維組織排列較為整齊，細胞結構也較為清晰，細胞間隙未見明顯的滲出且炎性細胞浸潤相對減少，說明Sevo預處理可以在一定程度上對抗LPS所導致的心肌損傷。不僅如此，心肌細胞血清酶學檢測的結果也印證了這一結果，LPS組小鼠血清的LDH和CK－MB顯著升高，說明心肌有損傷;而Sevo預處理的小鼠血清LDH和CK－MB水平則顯著下降，說明心肌損傷有減輕。因此，七氟醚預處理可在一定程度上對抗LPS所致的心功能障礙，保護心肌組織結構，減輕心肌細胞的損傷。

目前，LPS引起心功能障礙的機制尚未完全闡明。LPS引起心肌細胞大量生成NO可能發揮了重要作用。血管內皮細胞中的NOS催化L－精氨酸，經過一系列反應而生成NO，作為氣體信號分子，在生理和病理條件下，均具有重要的調節血管功能的作用:生理狀態下，適量的NO水平對維持血管張力的恒定和調節血壓的穩定有重要作用，有心血管的保護作用;而過量的NO，作為一種炎癥介質或反應極強的自由基，可直接或間接引起心肌損傷:(1)NO與超氧離子反應生成過氧亞硝基(ONOO－)，可影響蛋白質的結構、功能和/或催化活性，對心肌細胞產生直接毒性作用;(2)NO激活心肌細胞中鳥苷酸環化酶，促進磷酸鳥苷環化產生環磷酸鳥苷(cGMP)，繼而激活依賴cGMP的蛋白激酶G(protein kinase G，，PKG)，使心肌肌鈣蛋白I的磷酸化作用加強，肌鈣蛋白C對Ca2+的親合性下降，同時減少Ca2+內流［9］;(3)過量的NO可抑制心肌細胞線粒體呼吸相關酶，干擾心肌能量代謝［10］等。本實驗中，LPS處理后12 h，小鼠心肌組織NO含量升高，而Sevo預處理組NO則顯著下降，表明七氟醚預處理對抗LPS所致心功能障礙的作用機制可能與其抑制LPS誘導的心肌NO升高有關。

我們知道，NO的產生與一氧化氮合酶(NOS)關系密不可分，NOS可分為結構型(cNOS)和誘導型(iNOS)，cNOS在生理狀態下合成少量NO，參與信息轉導、調節血管緊張度、調節血小板聚集等正常生理調節作用;iNOS常被內、外毒素和細胞因子激活，合成大量NO，行使其免疫信使和細胞毒的作用。在LPS誘導下，心肌細胞亦可大量表達iNOS，合成過量的NO，繼而發揮損傷作用［11］。有學者［12－13］分別在腦、腎缺血再灌注損傷的研究中發現，七氟醚預處理在缺血再灌注損傷時可抑制iNOS的激活，抑制海馬組織、腎組織的NO水平升高，發揮器官保護作用。本實驗結果亦顯示，LPS處理后12 h，小鼠心肌組織iNOS活性升高，而Sevo預處理組較LPS組顯著降低。因此，七氟醚預處理可能通過抑制iNOS活性、減少NO的產生而發揮其對內毒素血癥小鼠心肌的保護作用。

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Effects of sevoflurane preconditioning on myocardial dysfunction in lipopolysaccharide－challenged mice

LI Jian－ling1，ZHU Xiao－qing2，LI Xue－min2，LI Hong－mei2，WANG Yan－ping2，WANG Yuan2，QI Ren－bin2，LI Ya－lan1
(1Department of Anesthesiology，the First Affiliated Hospital，2Department of Pathophysiology，Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine of People＇s Republic of China，School of Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E－mail:tyalan@jnu.edu.cn;tqirb@jnu.edu.cn)

AIM:To investigate the effects of sevoflurane(Sevo)preconditioning on myocardial dysfunction in lipopolysaccharide(LPS)－challenged mice.METHODS:Forty male BALB/c mice were randomly allocated to 4 groups: control group，LPS group，Sevo+LPS group and Sevo group.Following pretreatment with or without 2%Sevo for 30 min and washing out for 10 min，all mice

intraperitoneal injection of LPS or normal saline(NS).The mice received an echocardiographic evaluation by a high－resolution in vivo imaging system 12 h after administration of LPS or NS.The mice were then killed and the hearts were removed for histological analysis.Serum levels of lactic dehydrogenase(LDH)，creatine kinase－MB(CK－MB)were measured with an automatic biochemical analyzer.The myocardium was homogenized for detecting the activity of inducible nitric oxide synthase(iNOS)and the content of nitric oxide(NO).RESULTS:Echocardiographic evaluation demonstrated that LPS resulted in an increase in lert ventricular end－diastolic volume and significant decreases in stroke volume，cardiac output and ejection fraction.The alteration of cardiac functions was inhibited by the pretreatment with Sevo.LPS caused significant elevation of LDH and CK－MB in serum samples and severe pathological damage of the hearts.Compared with LPS group，serum levels of LDH and CK－MB were reduced and pathological damage was attenuated in Sevo+LPS group.Sevo preconditioning also significantly attenuated the increases in iNOS and NO induced by LPS.CONCLUSION:Sevo preconditioning protects against myocardial impairment and myocardial dys-function in LPS－challenged mice.Inhibition of iNOS activity and of NO production by Sevo preconditioning may contribute to the beneficial role in the process of cardioprotection during endotoxemia.

Sevoflurane;Preconditioning;Lipopolysaccharides;Cardioprotection;Nitric oxide synthase;Nitric oxide

R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2012.08.013

1000－4718(2012)08－1410－05

2012－06－26

2012－07－09

廣東省科技計劃項目(No.2009B030801032);中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(No.21612446)

△通訊作者李雅蘭Tel:020－38688200;E－mail:tyalan@jnu.edu.cn;戚仁斌Tel:020－85220253;E－mail:tqirb@ jnu.edu.cn