晝夜節律蛋白Cry2作為結直腸癌預后和化療敏感性預測因子的研究*

周俊懌， 方樂堃， 鄧艷紅， 劉煥亮， 王 磊， 汪建平， 黃美近

(中山大學附屬第六醫院，廣東廣州510655)

晝夜節律(circadian rhythm)是以24 h左右為周期變動的生命活動，又稱近日節律［1］。越來越多的流行病學調查發現晝夜節律的紊亂與乳腺癌、結腸癌的發病相關［2－5］。動物都存在著維持晝夜節律的系統——晝夜節律蛋白，目前至少發現9種晝夜節律蛋白(Clock、Per1、Per2、Bmal1、Cry1、Cry2、Tim、酪蛋白激酶1和糖原合酶激酶3β)［6－8］。目前對晝夜節律及其調控蛋白研究日益深入，晝夜節律對結直腸癌的發生、發展、預后存在影響，但目前尚未有報道使用晝夜節律蛋白對結直腸癌的預后進行評估。本文旨在探索用晝夜節律蛋白Cry2對結直腸癌的預后及新輔助化療敏感性、新輔助化療后的生存期進行預測。

材料和方法

1 材料與對象

選16名規律地接受包含5－氟尿嘧啶的新輔助化療的結直腸癌切除術患者。使用結腸鏡獲取新輔助化療之前的腫瘤標本。通過CT/MRI計算腫瘤體積的減少率或腫瘤反應速度，從而反映化療療效。使用實體腫瘤療效評估標準來評估化療療效:完全反應(complete response，CR;病灶消失)、部分反應(partial response，PR;縮小≥30%)、病灶穩定(stable disease，SD;縮小＜30%或增大≤20%)和病灶進展(progress disease，PD;增大≥20%)。同時，我們收集307名在2001年至2005年間接受結直腸癌切除術的患者的腫瘤標本與隨訪資料，這些患者未接受新輔助治療。本研究通過醫院倫理委員會的批準。以總生存為結束點，生存時間從手術當天算起，直至死亡或者最后一次隨訪的時間。

2 主要試劑

免疫組化試劑盒和3，3'－二氨基聯苯胺(3，3'－diaminobenzidine，DAB;北京中杉金橋生物技術有限公司);兔單克隆抗體Cry2(Abcam)。

3 方法

3.1 組織芯片(tissue microarray，TMA)制作［9］組織石蠟塊對照其相應的HE染色玻片，確定腫瘤組織位置，為確保組織芯片樣本代表性及防止掉片導致信息丟失，使用組織芯片儀(MiniCore，ALPHELYS)以直徑2 mm在石蠟塊上取出選定組織(每份標本取2份組織)。每個標本取2個點，制成組織芯片蠟塊，每個芯片蠟塊含12×8個點。標本置于免疫組化專用防脫片載玻片上，制作成組織芯片玻片。

3.2 免疫組織化學 TMA玻片在二甲苯脫蠟，通過梯度的乙醇重新水化，清水洗凈后，置于枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6)中，使用微波加熱3 min修復抗原。冷卻后，于3%過氧化氫中浸泡10 min，消耗內在的過氧化物酶，再在室溫下予10%正常山羊血清孵育20 min，封閉非特異性抗原。最后將組織芯片覆蓋上兔單克隆抗體Cry2(Abcam，1∶100稀釋)，置于濕盒中4℃過夜。接著將芯片置于Ⅰ抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)中室溫孵育1 h，最后滴加DAB。最后，用蘇木素復染，鹽酸酒精脫色，并封片。使用普通兔IgG代替Ⅱ抗作為陰性對照。使用免疫組化檢測陽性的組織作為陽性對照。

3.3 免疫組化檢測的評分標準 所有標本均于100和200倍放大下獲取圖片，并由2名獨立的病理醫生單獨閱片，使用Image－Pro Plus 6.0進行細胞計數，并進行半定量評分(immunoreactivity score，IRS)。陽性腫瘤細胞比例，1分:＜25%;2分:25%～50%;3分:50%～75%;4分:＞75%。表達強度，0分:無表達;1分:弱陽性;2分:中等陽性;3分:強陽性。然后將2個分數相乘，通過繪制ROC曲線獲得分界值，IRS 0～4分定義為Cry2低表達，IRS 5～12分定義為Cry2高表達。

4 統計學處理

使用SPSS 16.0對數據進行統計分析。ROC曲線分析確定Cry2高、低表達的分界點。Cry2表達和結直腸癌患者的臨床病理特點間的關系用χ2檢驗進行分析，用log－rank檢驗進行單因素生存分析，用Cox回歸模型確定獨立預后因素，用Kapla－Meier法繪制生存曲線。設定雙側P＜0.05為有意義結果。實驗重復3次。計量資料以均數±標準差(s)表示。

結果

1 Cry2在化療敏感和化療抵抗病例中的差異

16名接受以5－氟尿嘧啶為基礎的新輔助化療的結直腸癌患者，以化療反應分成2組，CR/PR組8名患者，SD/PD組8名，結果表明，CR/PR組Cry2表達較低，SD/PD組Cry2表達較高，見圖1。因為總例數為16例，少于40例，用Fisher確切概率檢驗進行分析，差異有統計學意義，見表1、圖2。

Figure 1.Expession of Cry2 in colorectal cancer tissues from chemotherapy－sensitive(A)and chemotherapy－resistant(B)patients(immunohistochemical staining，×200).圖1 化療敏感和化療抵抗患者結直腸癌組織Cry2的表達

表1 新輔助化療患者Cry2的表達Table 1 .Expression of Cry2 in patients with neoadjuvant chemotherapy(n=8)

Figure 2.Comparison of Cry2 expression between CR/PR and SD/PD groups.CR/PR:complete response/partial response;SD/PD:stable disease/progress disease. s.n=3.＊＊P＜0.01 vs CR/PR group.圖2 CR/PR組和SD/PD組Cry2表達的比較

2 307例結直腸癌患者基本資料

收集307名2001年至2005年間接受結直腸癌切除術的患者，并按Cry2表達的強弱分成2組，見表2。這2組在性別、年齡、腫瘤位置、組織分級、腫瘤分期及采納化療各方面無顯著差異，具可比性。

3 Cry2表達高低對總生存時間的影響

性別、年齡、組織分級、病理學T分期和是否化療對患者的總生存時間均無影響，腫瘤位置、淋巴結轉移、遠處轉移及Cry2表達情況對總生存時間存在影響。結腸腫瘤、無淋巴結轉移及遠處轉移、Cry2低表達預后較好，見表3、圖3。

4 Cry2表達是影響預后的獨立因素

性別、病理學T分期、化療與否對生存的影響并非獨立的，年齡、腫瘤位置、組織分級、病理學N分期、病理學M分期和Cry2的表達是影響預后的獨立因素，見表4。

5 Cry2表達是影響化療預后的獨立因素

年齡、腫瘤位置、組織分級、病理學T分期對化療影響并非獨立的。性別、病理學N分期、病理學M分期和Cry2的表達是影響化療預后的獨立因素，見表5、圖4。

討論

1 Cry2對新輔助治療的指導作用

Cry2的表達與晝夜節律調整有關［10］，而晝夜節律與腫瘤的發生有關［2－5］，結果顯示SD/PD組Cry2表達較高，而CR/PR組Cry2表達較低。這充分說明了Cry2高表達時化療療效較差，而Cry2低表達時化療療效較好。進一步可以說明，Cry2高表達時，患者化療效果差，可不考慮行新輔助化療，Cry2低表達時，化療效果好，可考慮行新輔助化療。當然我們的研究中，病例數仍然不足，需繼續擴大病例數，使結果更為可信。

表2 2001～2005年結直腸癌手術患者Cry2的表達情況Table 2 .Expression in Cry2 in patients with colorectal cancer excision between 2001 and 2005

Figure 3.The different overall survival time of all the patients with high and low Cry2 expression.圖3 所有病人Cry2表達高低對總生存時間的影響

表3 患者不同預后參數的單因素分析Table 3 .Univariate analysis of the average survival time of all the patients

表4 所有患者不同預后參數的多因素分析Table 4 .Multivariate analysis of the overall survival time of all the patients(n=307)

表5 患者接受新輔助化療后不同預后參數的多因素分析Table 5 .Multivariate analysis of the overall survival time of the patients with neoadjuvant chemotherapy(n=79)

Figure 4.The different overall survival time of the patients who received neoadjuvant chemotherapy between high and low Cry2 expression.圖4 新輔助化療病人Cry2表達高低對總生存時間的影響

2 Cry2預測CRC患者總生存的作用

AJCC第6版中，ⅡA和ⅡB期5年生存率分別為71.6%和 66.4%，IIIA、IIIB和 IIIC期分別為46.2%、40.1%和28.3%。2002年，美國國家癌癥數據中心研究發現，細化III期結腸癌分期標準可以進一步區分預后。其中IIIA期(T1～2，N1)5年生存率為59.8%、IIIB期(T3～4，N1)5年生存率為42.0%，IIIC期(任何T，N2)5年生存率為27.3%(P＜0.01)。本研究中，Cry2高表達的病人總生存時間比Cry2低表達的患者總生存時間短。Cry2表達的高低與性別、年齡、腫瘤位置、組織學等級、病理學分級等無關，同時多因素COX回歸分析的結果顯示，Cry2高表達可以作為提示結直腸癌患者預后差的獨立因素。這將為評估患者預后帶來巨大的方便，僅僅通過免疫組化的方法，就可以對結直腸癌患者預后進行評估，但是目前我們的樣本量仍然有限，在下一步研究中，應繼續擴大樣本量，并進行多中心研究，明確Cry2作為預后因子的作用。在單因素分析中，其它提示總生存率低的因素分別是腫瘤位置(P＜0.01)、淋巴結轉移(P＜0.05)和遠處轉移(P＜0.01)。

3 Cry2預測新輔助化療效果的作用

文獻報道晝夜節律對化療療效有相當顯著的影響［11－20］。在我們的實驗中，我們分析了結直腸癌患者的Cry2表達和新輔助化療治療結果之間關系(表5、圖5)。新輔助化療以5－氟尿嘧啶為基礎，加或不加亞葉酸鈣或草酸鉑。Kaplan－Meier分析顯示，Cry2高表達的患者化療后總生存時間仍比對照組短(P＜0.05)，與所有病人(化療和不化療的病人)的總生存情況類似，這說明化療并不能使Cry2表達高的患者生存期延長至與Cry2表達低的患者相同，提示Cry2可以作為化療的預測分子標志物。多因素Cox回歸分析顯示，Cry2高表達預示著更差的預后，所以Cry2可以作為一個獨立的因子，預測結直腸癌患者新輔助化療后的預后情況。

［1］ Bass J.Physiology:on time metabolism［J］.Nature，2011，480(7378):466－467.

［2］ Chen－Goodspeed M，Lee CC.Tumor suppression and circadian function［J］.J Biol Rhythms，2007，22(4): 291－298.

［3］ Stevens RG.Circadian disruption and breast cancer:from melatonin to clock genes［J］.Epidemiology，2005，16 (2):245－258.

［4］ Hansen J，Stevens RG.Case－control study of shift－work and breast cancer risk in Danish nurses:impact of shift systems［J］.Eur J Cancer，2012，48(11):1722－1729.

［5］ Schernhammer ES，Laden F，Speizer FE，et al.Rotating night shifts and risk of breast cancer in women participating in the nurses’health study［J］.J Natl Cancer Inst，2001，93(20):1563－1568.

［6］ Badiu C.Genetic clock of biologic rhythms［J］.J Cell Mol Med，2003，7(4):408－416.

［7］ Ko CH，Takahashi JS.Molecular components of the mammalian circadian clock［J］.Hum Mol Genet，2006，15 (Suppl 2):R271－R277.

［8］ Barnes JW，Tischkau SA，Barnes JA，et al.Requirement of mammalian timeless for circadian rhythmicity［J］.Science，2003，302(5644):439－442.

［9］ 蔣 李，王 磊，黃美近，等.TPI－2表達與結直腸癌發生發展的關系與意義［J］.中國病理生理雜志，2011，27 (7):1403－1405，1413.

［10］ Gauger MA，Sancar A.Cryptochrome，circadian cycle，cell cycle checkpoints，and cancer［J］.Cancer Res，2005，65(15):6828－6834.

［11］ Giacchetti S，Itzhaki M，Gruia G，et al.Long－term survival of patients with unresectable colorectal cancer liver metastases following infusional chemotherapy with 5－fluorouracil，leucovorin，oxaliplatin and surgery［J］.Ann Oncol，1999，10(6):663－669.

［12］ Adam R，Avisar E，Ariche A，et al.Five－year survival following hepatic resection after neoadjuvant therapy for nonresectable colorectal liver metastases［J］.Ann Surg Oncol，2001，8(4):347－353.

［13］ Lévi F，Zidani R，Misset JL.Randomized multicentre trial of chemotherapy with oxaliplatin，fluorouracil，and folinic acid in metastatic colorectal cancer［J］.Lancet，1997，350(9079):681－686.

［14］ Halberg F，Haus E，Cardoso SS，et al.Toward a chronotherapy of neoplasia:tolerance of treatment depends upon host rhythms［J］.Experientia，1973，29(8):909－934.

［15］ Levi FA，Hrushesky WJ，Blomquist CH，et al.Reduction of cis－diamminedichloroplatinum nephrotoxicity in rats by optimal circadian drug timing［J］.Cancer Res，1982，42 (3):950－955.

［16］ Levi F.Chronopharmacology of anticancer agents［M］.∥Redfern PH，Lemmer B.Physiology and pharmacology of biological rhythms.1st ed.Berlin:Springer，1997:299－331.

［17］ Levi F.From circadian rhythms to cancer chronotherapeutics［J］.Chronother Int，2002，19(1):1－19.

［18］ Eriguchi M，Fujii Y，Takeda Y，et al.Chronotherapy: application to chemotherapy for gastric cancer and colorectal cancer［J］.Oncologia，1992，25(35):118－120.

［19］ Eriguchi M，Osada I，Fujii Y，et al.Pilot study for preoperative administration of 1－OHP to patients with advanced scirrhous type gastric cancer［J］.Biomed Pharmacother，1997，51(5):217－220.

［20］ Eriguchi M，Nonaka Y，Yanagie H，et al.A molecular biological study of anti－tumor mechanisms of an anticancer agent Oxaliplatin against established human gastric cancer cell lines［J］.Biomed Pharmacother，2003，57 (9):412－415.