正交實驗法優選腸瀉停膠囊的提取工藝＊

竇 芳 陳曉莉 文愛東 第四軍醫大學西京醫院藥劑科（西安 710032）

腸瀉停膠囊系由黃柏、地榆、石榴皮、地錦草4味藥材組成，具有清熱燥濕，涼血解毒的功能，用于濕熱蘊結導致的急、慢性腸炎，泄瀉、痢疾等腸道疾病。黃柏為腸瀉停膠囊的主要組成部分，性味苦寒，有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡之功效。黃柏傳統內服主治濕熱帶下，熱淋腳氣，瀉痢黃疸，陰虛發熱，盜汗遺精等，同時黃柏治療癰瘍腫毒功效顯著，此外還常用于治療皮膚濕疹，水火燙傷［1］。《本草綱目》記載：“地榆，除下焦熱，治大小便血證。止血，取上截切片炒用，其梢則能行血，不可不知。楊士瀛云：諸瘡痛者加地榆，癢者加黃芩”。《本草綱目》記載：石榴皮“止瀉痢，下血，脫肛，崩中帶下”。《浙江民間草藥》記載：地錦草“健胃止瀉，治小兒疳積”。黃柏中主要含有鹽酸小檗堿，地榆、石榴皮、地錦草中均含有鞣質，故提取工藝中選擇鹽酸小檗堿、鞣質為檢查指標，采用正交實驗法考察提取工藝，以確定最佳提取方案。

1 儀器與試藥 1.1 儀器Agilent 1200液相色譜儀（含真空脫氣機，二元泵，自動進樣器，柱溫箱）；色譜柱：Agilent TC－C18柱（150mm×4.6mm，5μm）。

1.2 試藥 鹽酸小檗堿對照品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110713－200910）。

2 方法與結果 通過參考各藥材藥理作用中所提及的提取方法，對醇提、水煎煮提取工藝進行研究。

2.1 實驗設計 處方中黃柏為主藥，而小檗堿等生物堿為其抗菌止瀉的主要有效成分。有文獻報道［2，3］，為避免小檗堿損失，黃柏不宜水煎，也不宜同其它藥材混煎。故選用乙醇對黃柏進行提取。用高效液相色譜法測定正交實驗提取物中鹽酸小檗堿的含量［4，5］，因此以鹽酸小檗堿的含量為評價指標。為了確定較為合理的提取工藝，按照通行的實驗設計［6］，擬采用L9（34）正交實驗的方法，對提取工藝中的參數進行優選，選取乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數4個主要的影響因素，各3個水平，按照L9（34）正交實驗進行實驗，選取最佳提取工藝參數。因素水平表見表1。

表1 L9（34）正交試驗因素水平表

2.2 實驗方法與結果 稱取黃柏10g，共9份，分別按正交試驗表所列條件進行實驗，提取，濾過，量取濾液體積，取適量的濾液兩份，分別測出干膏得量與鹽酸小檗堿含量。測定結果見表2。

2.2.1 出膏量的測定：精密吸取濾液10mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，105℃干燥6h，精密稱定，計算出藥材的干浸膏得量。

2.2.2 鹽酸小檗堿的含量測定：對照品溶液的制備：鹽酸小檗堿購自中國藥品生物制品檢定所，精密稱取鹽酸小檗堿適量，溶解制成每1mL含0.1mg的溶液。

樣品的測定 根據每次實驗中小檗堿的濃度不同，將濾液稀釋至適當濃度，分別吸取供試品溶液和對照品溶液各5μL，注入液相色譜儀，進行測定。結果見表2。

表2 正交設計試驗結果

2.3 方差分析 依據表2中的數據進行方差分析，結果見表3、表4。

表3 干浸膏量方差分析

表4 小檗堿含量方差分析

提取條件的優選 由表2，表3和表4可看出，因素A和D對小檗堿含量有顯著影響，影響因素D＞A＞B＞C，且以D3A2B3C2為佳。故確定黃柏中小檗堿的最佳提取工藝為D3A2B3C2，即用7倍量的70%乙醇熱回流提取3次，每次1.5h。

2.4 鞣質提取工藝的實驗設計 處方中石榴皮和地錦草主含黃酮類、鞣質類成分，地榆中主含鞣質、三萜皂苷類成分，以上各成分具有收斂、抗菌作用［7］，且可溶于水；另外用水煎煮簡便易行，且可降低能耗，節約成本。因此提取工藝選用水提取，為了優化最佳提取工藝，以水煎液的出干膏量及有效成分鞣質的含量為指標，考察加水倍量、煎煮時間、提取次數對提取效果的影響，應用L9（34）正交實驗的方法，見表5。

表5 L9（34）正交試驗因素水平表

2.5 實驗方法與結果 按處方取黃柏醇提藥渣定量，按一定比例稱取地榆、石榴皮和地錦草共22.5g，共9份，按各實驗號對應的提取液，加水煎煮，趁熱濾過，量取濾液體積，取適量的濾液兩份，分別測定出膏量與鞣質含量。測定結果見表6。

2.5.1 出膏量的測定：精密吸取濾液10mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，105℃干燥6h，精密稱定，計算出藥材的干膏得量。

2.5.2 鞣質的含量測定：按照鞣質含量測定法（中國藥典2010版一部 附錄XB）測定。

總水溶性部分的測定：精密量取供試品溶液25mL，蒸干，殘渣于105℃干燥3h，稱重（T1）。

不與皮粉結合的水溶性部分的測定：精密量取供試品溶液100mL，加皮粉（干燥品6g），振搖15min，濾過，精密量取濾液25mL，蒸干，殘渣于105℃干燥3h，稱重（T2）。

皮粉水溶性部分的測定：精密量取水100mL，加皮粉（干燥品6g），振搖15min，濾過，精密量取濾液25mL，蒸干，殘渣于105℃干燥3h，稱重（T0）。

按下式計算鞣質的含量：

鞣質含量＝T1―T2＋T0

2.6 方差分析 依據表6中的數據進行方差分析，結果見表7和表8。

提取條件的優選：由表6，表7和表8可看出，各因素對鞣質的含量影響不大，各因素影響C＞A＞B，且以C3A3B3為佳。從結果可看出因素B2和B3的結果差異很小，考慮成本因素，故確定該提取工藝為C3A3B2，即用15倍量的水煎3次，每次1.5h。

2.7 驗證實驗 以醇提最優提取工藝為D3A2B3C2和水提最優提取工藝為C3A3B2進行驗證實驗，黃柏藥材鹽酸小檗堿含量為13.9mg／g，藥材中鞣質含量為32.9mg／g。

表6 正交設計試驗結果

表7 干膏得量方差分析

表8 鞣質含量方差分析

3 結論與討論 本研究優化了該復方的提取工藝。通過正交實驗，確定該復方的最佳工藝為：取黃柏飲片，加7倍量的70%乙醇回流，提取3次，每次1.5h，趁熱過濾，合并濾液，回收乙醇，備用。然后將黃柏藥渣與其余3味藥材按處方量合并，用15倍量的水煎3次，每次1.5h，合并濾液，水浴濃縮到一定濃度，與黃柏濃縮液合并，繼續濃縮至一定濃度。該方法具有工藝條件合理、可靠，為腸瀉停膠囊工業化提取提供了科學依據。腸瀉停膠囊具有清熱燥濕，涼血解毒。用于濕熱蘊結導致的急、慢性腸炎，泄瀉、痢疾等腸道疾病。

［1］劉仁俊.黃柏化學成分及藥理作用淺談［J］.中國中醫藥現代遠程教育，2011，9（13）：83－84.

［2］周愛珍，尹 華，王知情.大黃、黃芩與黃柏藥對配伍提取工藝的研究 ［J］.中國中藥雜志，2012，4（37）：461－465.

［3］楊 宏，王天志，常艷波，等.川黃柏的HPLC指紋圖譜［J］.中國天然藥物，2006，4（5）：360－362.

［4］夏鵬宵，楊瀚春，袁洪澤，等.高效液相色譜法測定黃柏地榆膠囊中鹽酸小檗堿含量 ［J］.中國藥師，2009，2（12）：206－207.

［5］國家藥典委員會.中國藥典2010年版 ［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010.

［6］竇 芳，湯海峰，洪良建，等.太白楤木中楤木總皂苷提取純化工藝研究 ［J］.西北藥學雜志，2012，2（27）：101－103.

［7］付 軍，李 正.石榴皮鞣質的藥理學研究進展 ［J］.中國藥業，2011，24（20）：92－94.