食源性蛋白質自組裝纖維的研究進展

馮金鳳，劉春紅，馮志彪，*

(1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030;

2.東北農業大學理學院應用化學系，黑龍江哈爾濱150030)

近年來，食品科學家利用自組裝技術開始構建各種納米(微米)級尺度的功能性結構，如納米纖維、納米管及納米水凝膠等，并開始應用于穩定食品體系、輸送載體及風味控釋等方向［1］。食源性蛋白質具有良好的生物相容性，可在消化系統內被降解，同時具有獨特的自組裝特性，可在特定條件下形成纖維狀結構，有望成為新一代的功能性材料應用于食品工業。自組裝是一種普遍存在于生命科學體系中的現象，所謂自組裝是指分子、納米、微米或更大尺度的物質等基本構建單元自發形成有序結構的過程。1981年美國麻省理工學院的Eric Drexler最早提出采用自下而上式(bottom-up)構建納米材料的方法，且指出以蛋白質為構建單元通過自組裝能形成高度有序的結構［2］。Pallarès I等［3］研究發現，蛋白質自組裝纖維并不為少數病原性蛋白質所特有，與淀粉樣纖維無關的蛋白質同樣能聚集形成纖維狀結構。一些食源性蛋白質如 β-乳球蛋白［4-7］、牛血清白蛋白［8］、雞蛋清溶菌酶［9］、大豆蛋白［10-11］、蕓豆蛋白［12-13］等均可在低pH和低離子強度條件下，在變性溫度以上通過加熱自組裝形成纖維結構。本文主要闡述了食源性蛋白質自組裝纖維的形成機制和自組裝纖維過程的表征方法，以期為新型納米材料在食品工業中的具體應用提供理論支持。

1 自組裝纖維的結構特點

蛋白質在加熱條件下可以形成纖維狀結構，纖維的結構決定其功能。如圖1為β-乳球蛋白溶液在pH2、80℃下加熱數小時后形成的纖維透射電子顯微鏡(TEM)負染照片［14］。纖維的長度通常在 1～10μm之間，寬度約10nm，其線性的長寬比甚至可達500∶1。較大的長寬比例是纖維狀結構的最大特點，一方面，可使纖維在較低的濃度下形成充滿空間的網絡結構，使其成為一種有效的填充劑;另一方面，較大的長寬比例有效地改善了溶液黏性，使得纖維在較低濃度下具有高的儲能模量，這使其成為一種良好的食品添加劑，如在溶液中添加少量的原料蛋白就可達到好的膠凝和增稠效果。最近的研究表明，纖維的機械強度取決于組成纖維的股數，在特定條件下，多股纖維的直徑可達180nm［15-16］。

2 自組裝纖維的形成條件及作用機制

在食品體系中，球狀蛋白的自組裝通常是在強酸環境中進行的，此時的pH遠離蛋白質的等電點，球狀蛋白質之間的靜電排斥作用很強。當溶液的溫度高于變性溫度時，加熱使球蛋白變性，更多的疏水基團暴露，蛋白質分子間的疏水相互作用增強，疏水相互作用與靜電排斥作用達到平衡，促使了纖維的形成［17］。

圖1 β-乳球蛋白構建纖維的TEM照片Fig.1 TEM micrograph of protein fibrils derived from β-Lactoglobulin

目前，普遍認為蛋白質自組裝纖維化的形成機制為成核過程［18-20］。具體機制如圖 2 所示［21］，蛋白質濃度達到一定的臨界濃度是自組裝過程發生的前提條件，否則加熱時間再長蛋白質自組裝纖維化反應也不會發生。蛋白質的自組裝纖維化需要一定的“滯后時間”，稱為遲滯期，對應圖中A，在此期間緩慢形成一個有序的核心，成核是纖維形成的限速步驟;晶核形成后由于連接位點的增多，蛋白質單體很容易連接到晶核上，呈現快速生長或聚集過程，如果在超過蛋白質的臨界聚集濃度的溶液中加入一些晶核(或“種子”)，加速蛋白質的纖維化進程，對應圖中B;C表示自組裝形成了纖維。Bolder［22］研究了攪拌與加入晶種對乳清分離蛋白形成纖維的影響，結果表明:添加晶種對纖維的形成影響效果不如攪拌作用明顯，且提出纖維的形成有以下四個過程:活化、成核、生長、終止。活化與成核是纖維形成的限速步驟，纖維快速生長，經長時間加熱，蛋白質單體鈍化結果導致纖維形成終止。

圖2 蛋白質自組裝纖維形成的動力學曲線Fig.2 Kinetic curves of self-assembly of proteins into fibrils

Ardy和Loveday等人研究了β-乳球蛋白在pH2時不同溫度下(353～383K)加熱不同時間熒光強度的變化，結果顯示，在所有的溫度條件下，硫黃素T(ThioflavinT，ThT)熒光光譜均呈“S”型曲線，較長的初始時間內ThT熒光強度幾乎沒有變化，為淀粉樣自組裝纖維化的遲滯期，即成核階段所需時間較長。隨后熒光強度突然增大，為淀粉樣纖維化的生長期，即成核階段，后期熒光強度出現穩定的波動，即穩定階段，這證實了蛋白質自組裝纖維化的成核機制［5，23］。

反應時間影響反應的可逆性與不可逆性，進而影響蛋白質自組裝纖維的形成。蛋白質自組裝纖維化有兩種途徑(圖3所示)。一種途徑是蛋白質加熱先變性隨即自組裝形成纖維;另一種途徑是加熱變性后的蛋白質繼續進行酸水解反應，部分水解多肽自組裝形 成纖維。Bolder［22］和 Akkermans［15］等人 在pH2條件下加熱乳清分離蛋白，利用高效液相色譜法(HPLC)和十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析了加熱過程中蛋白質分子量的變化，結果表明，纖維由蛋白質酸水解的多肽組成，而不是由完整的蛋白質分子組成。

圖3 蛋白質自組裝纖維化的兩種途徑Fig.3 Two possible routes for fibrillisation of proteins self-assemble

Akkermans［24］研究了在 pH8，37℃ 條件下，β-乳球蛋白經天冬酰胺肽鏈內切蛋白酶處理，再將水解液的pH調到2，用透射電子顯微鏡(TEM)和ThT熒光測定觀察到長的纖維狀聚集物，進一步證實了形成纖維狀聚集物的構建單元是肽而不是完整的蛋白質分子。此外，只有將水解液的pH調整為2左右時，多肽才能聚集形成纖維，而pH為8時卻不能形成纖維，這說明肽的正電荷是形成纖維狀聚集物的重要原因。綜合以上研究結果推測:纖維形成的共同特點可能是蛋白質水解，部分水解多肽片段自組裝形成纖維。目前為止，完整的蛋白質能否形成纖維，以及如果能形成纖維所需要的具體環境條件，還沒有明確的答案。

2010 年 Tang等［13］在 pH2、離子強度 20mmol/L、85℃下，將蕓豆球蛋白加熱15～720min，發現自組裝形成纖維至少經歷三個步驟(圖4所示)。首先，蕓豆球蛋白的熱誘導變性和聚集(包括無定形聚集和纖維化聚集)，此過程較短(約15min)，原因是加熱溫度高于pH2下蕓豆球蛋白質的變性溫度，且變性和聚集的過程中蛋白質的二級、三級、四級結構均發生明顯變化;然后，可能由于疏水作用與靜電斥力的平衡作用，酸水解釋放的多肽片段聚集形成纖維，為多肽水解或自組裝纖維形成的初期，此步驟中，由于β-折疊含量的逐漸增加使得有序的二級結構重新排列，使得釋放的多肽片段更多地參與到纖維的形成過程中;最后，形成的纖維在加熱時間超過360min時發生團聚。

3 自組裝纖維化過程的表征

3.1 自組裝纖維的生長檢測

圖4 蕓豆蛋白自組裝纖維形成的機理示意圖Fig.4 Schematic illustration for the formation of fibrils from kidney bean proteins self-assemble

硫黃素T是一種能和蛋白質淀粉樣纖維特異性結合的陽離子苯并噻唑熒光染料。Biancalana等［25］研究表明，ThT通過與淀粉樣纖維的β-折疊結構特異性結合，在440nm的激發波長條件下產生480nm的特征熒光發射峰，且結合后的熒光強度隨著β-折疊結構數量的增多而增強，熒光強度的增強說明蛋白質內部結構發生變化，分子β-折疊結構數量增加，分子內部交聯形成蛋白質的纖維化結構。因此，可以通過ThT熒光強度的變化情況，判斷淀粉樣纖維的成熟情況，這是檢測淀粉樣纖維形成過程的一種典型方法。

Wang等［10］研究了大豆7S球蛋白(也稱β-伴大豆球蛋白)的三個主要亞基α＇-亞基、α-亞基、β-亞基在85℃、pH2條件下加熱0～20h的熒光光譜圖，結果表明，三個亞基的熒光強度均隨加熱時間的延長不斷增強，表明加熱過程中形成了成熟的纖維結構，但不同的大豆7S球蛋白的3個亞基熒光強度變化的峰值不同。加熱相同時間，α＇-亞基的峰值最高，其次依次為β-亞基、α-亞基，這表明在相同加熱條件下，α＇-亞基比β-亞基和α-亞基更容易形成自組裝纖維化聚集。

3.2 自組裝纖維形態的表征

原子力顯微鏡是在分子水平上探測表面形貌最先進的測試工具之一，它能提供蛋白質纖維化聚集的結構變化信息，包括長度、寬度以及螺距等，且能充分說明自組裝纖維的形成和結構特征。透射電子顯微鏡與原子力顯微鏡相比，更容易得到同一個樣品中較好的代表樣品高度與特征形貌等信息的圖片。因此，常利用原子力顯微鏡和透射電子顯微鏡相結合來研究蛋白質自組裝纖維的長度與微觀形態。

Oboroceanu等［7］采用原子力顯微鏡(AFM)研究了β-乳球蛋白在80℃下加熱0～20h的過程中自組裝形成纖維的情況，結果表明:0～85min內，β-乳球蛋白單體變形、伸展形成聚集物;85min后，形成具有雙螺旋結構的纖維，伸直長度大于 10μm。Oboroceanu等又采用TEM進一步確認了β-乳球蛋白的纖維形貌。

Tang 等［11］也采用 AFM 研究了大豆 7S、11S 球蛋白以及兩者1∶1的混合蛋白在pH2、80℃下加熱不同時間自組裝形成纖維的結構特點，研究表明，所有的大豆球蛋白形成的纖維均為類似的扭曲螺旋結構，但結構特性及纖維的形貌相差很大:7S球蛋白形成高度約為1.4～1.8nm的“蠕蟲狀”纖維;11S球蛋白則形成高度約為1.6～2.2nm的“輻射狀”纖維，甚至聚集成束;且7S球蛋白形成的纖維半峰寬低于11S球蛋白，而混合蛋白的螺旋周期明顯高于7S球蛋白。蛋白形成的纖維結構及形貌的差異可能由于蛋白質自身的結構不同造成的。

3.3 自組裝纖維化過程中二級結構的變化

圓二色譜法(CD)是研究溶液中蛋白質結構的一種有效技術，它的優勢是能夠從一系列的光譜區域內獲得蛋白質的結構信息［26］。傅利葉變換紅外光譜技術(FTIR)屬于振動光譜，酰胺Ⅰ帶和Ⅱ帶構象中α-螺旋和β-折疊分別對應特定的吸收峰，峰值隨著構象變化而發生改變，能動態地跟蹤蛋白質結構變化的過程［27］。因此，可以將CD和FTIR光譜結合起來研究蛋白質自組裝纖維化過程中二級結構的變化。

Tang等［11］利用 CD 法研究了大豆 7S、11S 球蛋白以及二者1∶1的混合蛋白在pH2、80℃下加熱過程中二級結構的變化，結果表明，在加熱的最初4h內，它們的二級結構變化很大，繼續加熱至12h，變化緩慢，此時可能形成β-折疊。結果還表明，大豆7S球蛋白比11S球蛋白更容易引起二級結構的改變。

Oboroceanu 等［7］研究了 β-乳球蛋白在 pH2、80℃下加熱0～20h，利用紅外光譜技術監測形成的纖維的二級結構的變化，結果表明，隨加熱時間的延長，α-螺旋含量下降，β-折疊含量增加。

3.4 自組裝纖維化過程中粒徑分布變化

動態光散射法(DLS)是一種可以對蛋白質聚集程度做定性分析的方法，對溶液中的微小聚集顆粒反應非常靈敏，當溶液中存在大于單體分子的顆粒時，掃描波長發生變化，散射的光密度與聚集顆粒的質量和數量成正比例關系，且聚集顆粒比單體顆粒散射更多的光［28］。與透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡相比，動態光散射法是從整體角度表征溶液中蛋白質粒徑尺寸及平均分布等信息。因此，可以根據動態光散射法測量的溶液中平均粒徑分布的變化來表征蛋白質自組裝纖維化的動態過程。

Wang等［10］利用DLS監測了7S球蛋白以及其三個主要亞基 α＇-亞基、α-亞基、β-亞基在 pH2、85℃條件下加熱的聚集過程，結果表明，隨加熱時間的延長，它們的散射強度變化趨勢一致。在反應初期，加熱均導致散射強度降低，這可能是由于此時7S球蛋白以及它的三個亞基多肽酸水解轉化為片段，繼續加熱，散射強度明顯增大。

Bolisetty等［29］利用 DLS 研究了 pH2、80℃ 加熱β-乳球蛋白，發現隨著加熱時間的延長，蛋白質單體顆粒的數量減少，平均粒徑較大的顆粒數量逐漸增多。這進一步證實了蛋白纖維聚集體的形成過程。

3.5 自組裝纖維化過程中蛋白質分子量的變化

十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)和分子排阻色譜法(SEC)是兩種常規測定分子量的方法，可以分別測定蛋白質亞基的分子量及完整蛋白質分子的分子量，而質譜分析法(MS)是目前測定蛋白質分子量最新的方法之一。因此，可以將三種方法結合起來測定自組裝纖維化過程中蛋白質分子量的變化。

Akkermans等［15］在 pH2，85℃ 條件下加熱 β-乳球蛋白，利用高效分子排阻色譜(HP-SEC)、MS、SDS-PAGE分析了加熱過程中蛋白質分子量的變化。研究發現，當β-乳球蛋白加熱至20h時，多肽分子量分布在2000u到8000u之間，纖維由此分子量的多肽組成，而不是完整的蛋白質分子。Bolder等［14］利用SDS-PAGE分析了乳清分離蛋白在pH2、80℃加熱過程中蛋白分子量的變化，也得到類似的結論。

4 自組裝纖維在食品中的潛在應用

食源性蛋白質自組裝形成的纖維呈細長狀且纖維的長度與直徑的比例很大，在食品中有許多潛在的應用價值。Akkermans等［30］添加纖維到乳清分離蛋白中，發現溶液的黏度和膠凝性均增強，表明纖維適合作為良好的增稠劑和膠凝劑應用在食品中。由于纖維增加了溶液的黏度，減緩了液體的流動性，且能在氣泡周圍覆蓋一層膜，因此可用作泡沫穩定劑。在合適的濃度范圍內，纖維還可作為有效的絮凝劑使用。在乳狀液中，纖維可以在水與油的界面形成膜。纖維的這種特性也可用于微膠囊的生產，多層纖維通過沉積在水包油乳狀液油滴的表面，可在透氣性與機械強度方面具有特殊的包埋功能［31-34］。

乳清蛋白中的主要成分β-乳球蛋白的致敏性問題是嬰幼兒奶粉生產中亟需解決的問題。最近研究發現，β-乳球蛋白纖維可作為β-乳球蛋白的替代物應用在食品中，降低由于β-乳球蛋白胃腸道消化產生的致敏性所致的營養成分的損失。Astwood指出酶處理的蛋白質在胃環境中越穩定，食物到達腸粘膜后引起致敏性的可能性就越大［35］。最近的研究顯示經胃蛋白酶處理的β-乳球蛋白纖維在胃中僅需要2min的時間即可消化，大大降低了乳類制品中β-乳球蛋白產生的致敏性，提高了食品的營養價值［36］。

5 結語

食源性蛋白質在特定的變性條件下自組裝能形成納米纖維狀結構，掌握纖維的形成條件、形成機理并選擇恰當的表征方法監測蛋白質自組裝纖維化聚集的過程，為纖維以一種新型納米材料應用于食品工業中做鋪墊。但其自組裝技術在研究與應用方面還存在很多問題與挑戰，自組裝機理方面的研究有待于進一步探討，此外，該方向的研究還處于實驗室階段，成本昂貴及耗時限制了納米材料的大規模合成與應用。因此，隨著實驗技術及基礎理論研究的深入，蛋白質自組裝合成的納米材料將進一步推動食品科學、生物醫學及生物納米技術的發展。

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