致乳糜瀉小麥麩質檢測方法研究進展

朱曉燕，袁娟麗，陳紅兵，高金燕

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047;2.南昌大學中德聯合研究院，江西南昌330047;3.南昌大學環境與化學工程學院，江西南昌330047;4.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西南昌330047)

小麥是世界上一種主要的經濟作物，富含淀粉、蛋白質、脂肪、礦物質等，具有較高的營養價值，在日常飲食中深受人們的喜愛。但同時，小麥也是一種嚴重的食物過敏原，可以引發多種過敏性疾病，如哮喘、運動激發過敏癥、蕁麻疹以及乳糜瀉等［1-2］。其中，乳糜瀉是遺傳易感者因攝入麩質(主要是小麥及其相似谷物的儲藏蛋白)而引發的慢性小腸炎癥疾病。該病過去被認為是種少見病，且有地域差異，以歐洲，尤其北歐多見，在西方國家的發病率為0.5%～2%［3-5］，我國近年來也報道了多例乳糜瀉病例［6-7］。由于人們對乳糜瀉認識的不夠，許多患者可能會被誤診為普通腸道疾病。但近年來隨著對該病發病機制認識的提高和診斷措施的不斷完善，發現乳糜瀉的患病率較以前明顯增高，且在亞洲國家的發病率也呈上升趨勢［8］。乳糜瀉臨床特征主要是腸粘膜絨毛萎縮，從而導致營養吸收不良、腹瀉、生長遲緩、貧血、骨質疏松等。目前，無麩質飲食是乳糜瀉唯一可靠的治療方式。我國是小麥消費大國，小麥食品在日常生活中扮演著重要的角色。但這對乳糜瀉患者卻是一個極大的威脅，因為極少量的麩質就會導致患病，這將嚴重影響患者的生活質量。而且由于食物配料的多樣化，食物的組成變得十分復雜，除了食品組分中標出的人為加入的麩質成分外，食品中其它組分以及各種食品在公用設備使用過程中產生的交叉污染都有可能給乳糜瀉患者帶來危害。因此，小麥、小麥類制品及其它食物中致乳糜瀉小麥麩質的檢測顯得尤為重要。

1 小麥中致乳糜瀉蛋白

小麥麩質(gluten)已明確為小麥中致乳糜瀉的蛋白，主要包括麥醇溶蛋白(gliadins)和麥谷蛋白(glutenins)，二者大約占小麥仁儲藏蛋白的80%，富含脯氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸殘基［9］。其中，半胱氨酸殘基對面團的形成和功能起著重要作用，它主要在蛋白間形成分子間二硫鍵，產生蛋白網狀結構，從而對面團的粘彈性產生重要的影響。

麥醇溶蛋白為單肽鏈，分子量較小，為 30～75ku［10］，通過分子內二硫鍵、氫鍵和疏水作用形成球狀結構(如圖1)，無分子間二硫鍵，它賦予面筋延展性，是影響小麥面筋烘烤品質的重要因素，主要包含α/β-、γ-、ω-型［11］。其中 α/β-、γ-型醇溶蛋白分子量在30～45ku之間，富含半胱氨酸;ω型醇溶蛋白分子量在45～75ku之間，但半胱氨酸含量較低［12］。

麥谷蛋白(如圖1)則是一類非均質的大分子聚合體，包含高分子量蛋白亞基(HMW:80～130ku)和低分子量蛋白亞基(LMW:10～70ku)［9］。其中 HMW亞基又可分為x型和y型亞基，LMW亞基可分為B-，C-和D-型亞基［13］。麥谷蛋白的氨基酸組成多為極性氨基酸，容易發生聚集作用，主要賦予面團彈性并決定面團的強度。

圖1 麥醇溶蛋白和麥谷蛋白［14］Fig.1 Schematic image of gliadins and glutenins

小麥麩質是乳糜瀉發生的必要條件，研究發現在麩質蛋白上存在許多特異性T細胞刺激性表位，特別是 α/β、γ-醇溶蛋白，HMW-和 LMW-麥谷蛋白上也存在這些表位［15］。這些特定的表位肽段在腸道粘膜固有層被抗原遞呈細胞表面的HLA-DQ2(或HLA-DQ8)受體識別，然后被呈遞給CD4+T細胞，從而導致細胞因子的產生，最終導致發病［16］。另外，麩質蛋白富含脯氨酸，這種獨特的結構特性使得麩質蛋白不容易被胃腸道消化酶完全降解，而生成一些較大的肽段(如長度為33個堿基的肽段)。這些麩質蛋白免疫顯性肽可能在腸道內長時間存在，加大了觸發T細胞反應的機率。

2 小麥麩質檢測方法

目前乳糜瀉尚無特效療法，所以患者嚴格避免食用含有麩質成分的食物是最佳選擇。然而，小麥消費已經遍布世界各地，已躋身于三大消費谷物之一。除了制作烘焙食品和意大利面外，麩質還被當做食品添加劑廣泛應用于食品工業中，且麩質也被用來制造個人護理用品、營養品和藥品。另外，傳統的無麩質產品和不含小麥的產品在生產、加工以及包裝過程中，還可能受到交叉污染。顯而易見，谷物及谷物片段在食品加工行業中無處不在。此外，最近一項臨床實驗證實腹腔能夠承受的麩質水平是攝入量每天不超過50mg的麩質蛋白［17］，但目前麩質的最低激發劑量未見報道［18］。食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission，CAC)規定無麩質食品的麩質含量不超過20mg/kg［19］。由此可見，食品中麩質含量的準確檢測，以及無麩質食品標簽的制定，對于乳糜瀉患者的健康和安全飲食極為重要。迄今為止，用于麩質含量檢測的方法主要包括ELISA法，免疫印跡法，質譜法，以及PCR法。

2.1 酶聯免疫吸附(ELISA)法

目前，市場上用于麩質定性和定量的方法主要是ELISA法，該法靈敏性高、特異性強、快速、費用低。用于檢測麩質的ELISA商業試劑盒有多種，這些試劑盒主要采用雙抗夾心法，檢出限范圍為2～10mg/kg［20］。但大多數試劑盒主要是基于 Skerritt抗體［21］和 R5 抗體［22］。Skerritt抗體主要是針對ω-醇溶蛋白，R5抗體則針對廣泛存在于 α/β-、γ-、ω-醇溶蛋白上的表位，包括 QQPFP、QQQFP、LQPFP、QLPFP等。有研究表明，Skerritt抗體對麥谷蛋白的親和力較麥醇溶蛋白高［20，22］，R5 抗體對麥醇溶蛋白的親和力較麥谷蛋白要高［22-23］。但很遺憾，這種親和力差異對麩質定量的影響在商業檢測試劑盒中尚未見報道。

目前，食品法典委員會(CAC)認可的檢測麩質含量的方法是基于R5抗體的夾心ELISA法［24］。該法既可以檢測天然的麩質蛋白也可以檢測加工過的麩質蛋白。但夾心ELISA法也具有局限性，它在檢測過程中需要待檢抗原含有兩個或兩個以上可被R5單抗識別的表位。通常，對于許多水解食物，在加工過程中，蛋白被打斷成碎片，最后可能只剩下一個毒性表位，在這種情況下，麩質蛋白仍能導致乳糜瀉的發生，但卻不易被檢測出。2011年，應食品法典委員會的要求，Mena等［25］開發出了基于R5抗體的競爭抑制性ELISA，該法可以很好的解決上述問題，其檢出限和定量限分別為0.72mg/kg和2.44mg/kg的麥醇溶蛋白。

當然，除了商業試劑盒外，還有許多實驗室的方法用于檢測麩質［26-28］。這些方法主要是麩質蛋白的提取方法和使用的抗體不同，如 Morón等［26］采用基于 33個堿基肽(LQLQPFPQPQLPYPQPQLP YPQPQLPYPQPQPF)的單抗進行夾心和競爭ELISA，其檢出限分別為1mg/kg和0.5mg/kg的麥醇溶蛋白。秦倩茹等［28］建立了檢測小麥醇溶蛋白的定量夾心ELISA法，采用的抗體為兔抗醇溶蛋白抗體，定量檢出限為7.81mg/kg。此外，還有基于α-、γ-醇溶蛋白肽的單抗和PN3(LGQQQPFPPQQPYPQPQPF)單抗等等，但這些方法均沒有得到食品法典委員會的認可。

迄今為止，現有的檢測麩質的ELISA方法仍存在缺陷。主要體現在以下幾個方面:a.重復性不夠高:ELISA法容易受到板包被、加樣、洗板、反應溫度和時間等許多因素影響，因而造成重復性差;b.易受抗體的影響:由于各種抗體的特異性不同，其檢測結果易出現假陽性和假陰性，甚至出現交叉反應;c.檢測對象的局限性:目前ELISA商業試劑盒使用的R5抗體和Skerritt抗體檢測的都是麥醇溶蛋白，而引發乳糜瀉的T細胞表位不僅存在于麥醇溶蛋白上，麥谷蛋白上也含有。理論而言，這兩種單抗用于檢測致乳糜瀉毒性麩質的準確性不如抗T細胞表位的抗體，但這種差異目前并沒有得到很好的比較研究。

ELISA方法使用的抗體比較關鍵，其結果的準確性關系到乳糜瀉患者的安全健康飲食。現存的各種檢測抗體，包括食品法典委員會認可的R5單抗，都存在著許多爭議。目前，并沒有統一的用于檢測麩質的抗體，因此，急需開發出一種能夠準確定量出致乳糜瀉毒性麩質的抗體。

2.2 免疫印跡法

根據定量免疫印跡的原理，也可以檢測出產品中麩質的含量［29-30］。該法主要是結合SDS-PAGE電泳和免疫印跡。在后期的印跡過程中，也是采用基于麩質的各種特異性抗體。如，Van den Broeck等［30］人開發出了基于T細胞表位的單克隆抗體Glia-α9和Glia-α20，并應用于免疫印跡檢測毒性表位。

由于免疫印跡技術的局限性，如在轉膜過程中，蛋白質轉印的好壞受多種因素的影響，且需根據印跡的強弱來確定麩質的量。因此，該法在麩質蛋白定量的精確性上還有待提高。目前，該法在篩查低致乳糜瀉毒性小麥及其他低乳糜瀉毒性谷物品種方面的應用比較多。采用此法，可以較直觀地比較出各品種麩質蛋白的種類與含量的差異，也可通過印跡的結果鑒定各單抗的特異性程度。

2.3 質譜法

基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)是第一個使用非免疫技術來檢測面粉和食物樣本中麩質含量的方法［31］，可以檢測面粉、淀粉類食物中的小麥醇溶蛋白、大麥醇溶蛋白、黑麥醇溶蛋白以及燕麥谷蛋白。與其它方法相比，該法同樣需要樣品前處理，但在整個檢測過程中不需要使用抗體，而是直接根據質譜模式圖定量出醇溶蛋白(25～40ku)。該法對于加工或非加工的麥類食品都適用，其檢測線性范圍 4～100mg/kg［31］。但是，MALDI-TOF-MS 法不能很好的檢測出非致乳糜瀉毒性谷物玉米、大米中含有的麥醇溶蛋白，因為大米、玉米本身含有大量的醇溶蛋白，會干擾麥醇溶蛋白質譜信號。為了解決這個問題，Hernando等［32］開發出了兩步法提取出小麥醇溶蛋白，并結合MALDI-TOF-MS法檢測以玉米、大米為基質的食品中麥醇溶蛋白的含量(30～45ku)，該法的檢測線性范圍為100～400mg/kg。

由于質譜法用于檢測麩質含量低于20～25mg/kg的樣本時，效果不好，因而不適用于低麩質水平的食物樣本的檢測。為了克服MS檢測麩質的缺陷，Sealey-Voyksner等［33］建立了一種液相色譜串聯質譜(LC-MS)的方法。液質聯用法是一種高效的分析技術，將色譜對復雜樣品的高分離能力，與質譜具有高選擇性、高靈敏度的優點結合起來，可以從復雜的食物基質中檢測出目標蛋白，在谷類蛋白研究方面得到了很好的應用。該法主要對各種常見市售麩質類食品和無麩質食品中與麩質密切相關的六個致敏肽(LQPQNPSQQQPQEQVPL、 TQQPQQPFPQQPQQPFPQ、VPVPQLQPQNPSQQQPQEQVPL、RPQQPYPQPQPQY、QPQQPFPQTQQPQQPFPQ和PQQSPF)進行檢測，其檢測線性范圍為0.01～100mg/kg，檢出限和定量限分別為1～30μg/kg和10～100μg/kg。液質聯用相比于單一的質譜法，對于低麩質含量的食品檢測具有較好的效果。

質譜分析具有靈敏度高、樣品用量少、分析速度快、分離和鑒定同時進行、質量精度高且結果可靠等優點，因而被廣泛運用于化學、化工、醫藥、材料、生命科學等各個領域。但是，與免疫學檢測方法相比，質譜法依賴貴重設備，費用較高、費時費力，不適用于食品行業的現場快速、大量檢測。隨著科學技術的發展，質譜法有望突破這些障礙，而廣泛的運用于食品行業麩質蛋白的檢測中。

2.4 聚合酶鏈式反應(PCR法)

繼質譜法后，又出現了另一種非免疫學方法—PCR法，并結合瓊脂糖凝膠電泳來檢測麩質蛋白的基因［34-35］。這種方法主要是通過體外擴增食品中的目標DNA序列，然后確定其是否含有麩質蛋白。

Debnath等［34］開發出的PCR法主要用于定性檢測麥谷蛋白，通過基因擴增，獲得麥谷蛋白135bp基因片段的PCR產物，陽性樣品通過擴增可以呈現135bp的基因片段。該法的檢出限為21.5pg DNA。而柯燕娜等［35］建立了一種常規PCR法，用于檢測各種原料和加工食品中的小麥麩質。該法針對小麥的ω-醇溶蛋白設計了一對擴增片段大小為185bp的引物，檢出限為10ng。但是，常規PCR法的缺陷是不能定量出麩質含量，而且它檢測的只是單一的麥谷蛋白或麥醇溶蛋白的DNA，具有很大的局限性。

值得欣慰的是，隨著熒光定量PCR(Q-PCR)的介入，該方法被成功地應用于檢測食品中小麥麩質的DNA含量。Mujico等［36］開發出了一種Q-PCR系統用于檢測小麥麩質蛋白的DNA，其定量限為20pg DNA，并將此法與R5 ELISA法進行比較。結果發現，除了水解和深加工的食品外，對于其它食品，不僅麩質含量高于1.5mg/kg(R5 ELISA試劑盒定量限)的食物樣本，而且麩質含量低于1.5mg/kg的食物樣本，Q-PCR都可以檢測出陽性信號，表明其敏感性優于R5 ELISA法，是檢測食品中是否存在麩質的一種有效的非免疫學方法。

無論是常規PCR還是Q-PCR，其在檢測食物基質復雜、麩質含量低的食品上都具有優勢。但是麩質成分復雜，表達該蛋白的基因也相應多種多樣，以上兩種方法每次只能檢測某單一蛋白的DNA，且引物的設計和選擇比較關鍵，易出現假陽性或假陰性擴增。同時，即使是Q-PCR也只能定量出DNA的含量，并不能直接獲得食物中麩質蛋白的準確含量。

3 結語

乳糜瀉是一種與小麥消費密切相關的食物過敏疾病，其發病率隨著小麥消費量的增加呈上升趨勢。麩質蛋白的準確檢測對于低麩質和無麩質產品標簽的制定至關重要。同時，也與食品安全控制、標示、安全預警等密切相關。各種檢測麩質蛋白的技術除可以保障乳糜瀉患者安全消費外，還可運用于其它食物過敏原的檢測，是保障食品安全的支撐技術。現有的各種檢測技術還存在許多缺陷，隨著對乳糜瀉發病機制以及麩質蛋白更進一步的了解，更為準確、安全、經濟、快速、適用性廣、高靈敏性的檢測技術將會應運而生。

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