桉葉脂肪酸提取成分的MS優(yōu)化分析

吳志華，楊巧麗，李天會(huì)，張 婧，謝耀堅(jiān)

(國家林業(yè)局桉樹研究開發(fā)中心，廣東湛江524022)

桉樹(Eucalyptus)是我國南部地區(qū)廣泛種植的重要人工林樹種［1］，除作為速生豐產(chǎn)林生產(chǎn)木材外，其葉可入藥，是我國廣西、云南和四川等地常用的中藥材;由桉葉油(桉葉蒸餾所得精油)中分離提純的1，8-桉葉油素，可以治療流感、咳嗽、腸炎、痢疾、風(fēng)濕骨痛、濕疹、神經(jīng)性皮炎等［1-2］。醫(yī)藥、化工上利用的主要桉葉品種是富含桉葉油素的主藍(lán)桉(Eucalyptus globulus)和檸檬桉(E.citriodora)等少數(shù)幾個(gè)種，而作為我國桉樹主栽品種之一的尾巨桉(E.urophylla×E.grandis)，因其含1，8-桉葉油素精油的含量相對(duì)較低被廢棄，未得到有效利用。目前研究中多針對(duì)桉葉精油成分，也有對(duì)桉葉黃酮類化合物［3］、鞣質(zhì)及酚類［4-5］等成分的分析報(bào)道。國內(nèi)外有關(guān)分析桉葉脂肪酸組成成分的報(bào)道中，多與抗寒性有關(guān)［6-8］，而關(guān)于桉葉片脂肪酸資源和利用方面的報(bào)道不多。目前脂肪酸分析測(cè)檢方法以氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)居多，在色譜條件中如程序升溫初始溫度和升溫速率對(duì)成分分離快慢和分離好壞有直接關(guān)系，因此色譜條件是否能滿足分析需求還存在疑問。響應(yīng)面法(RSM，response surface methodology)通過一系列確定性的“實(shí)驗(yàn)”擬合響應(yīng)面來模擬真實(shí)極限狀態(tài)曲面，從而很容易地進(jìn)行可靠性分析，因其具備經(jīng)濟(jì)性、實(shí)驗(yàn)次數(shù)少和實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短等特點(diǎn)［9］，廣泛用于實(shí)驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化過程中［10］。本研究在前期基礎(chǔ)上，以超聲波獲得的尾巨桉DH32-29葉片脂肪酸提取物為材料，對(duì)脂肪酸組成成分檢測(cè)中GC-MS色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，旨在建立行之有效的桉葉脂肪酸的檢測(cè)方法，為桉葉資源評(píng)估以及開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桉葉 來源于尾巨桉DH32-29，為2年生健康植株樹冠中部的葉片，2011年4月12日于廣東湛江市遂溪的南方國家級(jí)種苗基地內(nèi)所采集;石油醚、正己烷、甲醇、濃硫酸、無水硫酸鈉 均為分析純。

JJ-2型組織破碎機(jī) 江蘇省金壇市金南儀器廠;KQ5200DE超聲波處理器 江蘇省昆山市超聲儀器有限公司;N-1100S-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本EYELA公司;Agilent 7890GC-5975MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.2 粗脂的提取

桉葉經(jīng)風(fēng)干后，70℃烘干1h，過0.5mm篩粉碎備用。提取方法參照文獻(xiàn)［11］實(shí)施:取干燥桉葉粉(80～150 目)10g，加入石油醚(沸點(diǎn)60～90℃)80mL，浸泡10～12h，進(jìn)行超聲波萃取(頻率為40kHz、溫度為30℃)，萃取3次，每次20min，溶液過濾后，加入20mL石油醚(沸點(diǎn)60～90℃)沖洗濾渣，再次過濾，濾液合并后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾，回收石油醚，得到桉葉粗脂，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 脂肪酸甲酯化處理

采用1%硫酸-甲醇酯化法［12］:取粗脂0.5g于具塞三角瓶中，加入1%硫酸-甲醇溶液20mL，充分振蕩，50～60℃水浴1h，靜置后加入20mL正己烷，振蕩均勻，靜置15min，取上層萃取液離心，將離心后的上清液作為分析試樣。

1.4 GC－MS條件

1.4.1 色譜條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn) HP-5MS 30m×0.25mm×0.25μm石英彈性毛細(xì)管柱，載氣為高純氦氣，進(jìn)樣口溫度 260℃，流速 1mL/min，進(jìn)樣量 1.0μL，分流比20∶1。在程序升溫常規(guī)參數(shù)［11］基礎(chǔ)上，分別就色譜條件程序升溫中的8個(gè)因素進(jìn)行了最優(yōu)響應(yīng)面設(shè)計(jì)(D-optimal Algorithm)［13］，得 55 個(gè)處理組合。實(shí)驗(yàn)因素編碼與水平見表1，處理組合見表2。

表1 實(shí)驗(yàn)因素編碼與水平Table 1 Factors with different levels in the D-optimal RSM experiment

表2 實(shí)驗(yàn)處理組合Table 2 Factors combination of experimental treatments in the D-optimal RSM experiment

1.4.2 質(zhì)譜條件 EI電離源，電子能量70eV，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，EM電壓1024V，質(zhì)量掃描范圍40～600u。

1.4.3 定性與定量分析 根據(jù)GC-MS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)利用NIST08譜圖庫進(jìn)行自動(dòng)檢索，并結(jié)合人工圖譜解析，對(duì)提取物成分進(jìn)行定性分析。采用色譜峰面積歸一化法確定各成分的相對(duì)百分含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)指標(biāo)和建模分析

以脂肪酸成分的相對(duì)含量(Y1)、脂肪酸種類數(shù)(Y2)、Simpson指數(shù)(Y3，可檢測(cè)出的成分種類的多樣性指數(shù))、離子譜圖質(zhì)量(Y4)(根據(jù)的色譜圖峰的分離度、分布等分成3級(jí)，1級(jí)別表示色譜圖譜差，峰分離不清晰、不均勻，拖尾、甚至出現(xiàn)基線漂移，2級(jí)別表示譜圖分離效果一般，3級(jí)別表示譜圖質(zhì)量好，以0表示不能實(shí)施的處理組合)為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，采用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行建模分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉葉脂肪酸相對(duì)含量

分別對(duì)尾巨桉 DH32-29無性系桉葉粗脂進(jìn)行GC-MS處理分析(圖1)，對(duì)分離出來的脂肪酸相對(duì)含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，除不能實(shí)施的處理號(hào)19、28、29、31、37、46、48、52 外，平均相對(duì)含量達(dá)到 72.3%以上，最小值為57.0%(處理號(hào)21)，處理號(hào)33達(dá)到最大值86.9%。

圖1 不同GC-MS條件下檢測(cè)出的脂肪酸情況Fig.1 The content，kind，Simpson index and TIC of fatty acids under the different GC-MS conditions

分別對(duì)甲酯化的尾巨桉葉片粗脂進(jìn)行不同的程序升溫條件下分析檢測(cè)，以Design-Expert進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)建模分析，得到有效Y1回歸模型方程(R2=0.863，p=6.4×10-3)如下:

注:式(1)中，Y1為脂肪酸成分的相對(duì)含量，A-H因子前的各數(shù)字為標(biāo)準(zhǔn)化的回歸系數(shù)，其中因素后的*、＊＊分別表示在0.05、0.01水平上差異。

從式(1)可知，對(duì)于脂肪酸成分的相對(duì)含量(Y1)來說，因子主效應(yīng)中，因子C(升溫速率1)中回歸系數(shù)絕對(duì)值最大為11.69，其次為因子F的回歸系數(shù)(7.89)，因子G的回歸系數(shù)絕對(duì)值為6.80，因子E的回歸系數(shù)絕對(duì)值為6.39，這4個(gè)因子影響均達(dá)到顯著水平以上，而因子B回歸系數(shù)絕對(duì)值最小為4.31，因此影響桉葉提取物分離檢測(cè)的的因素從大到小依次為:C＞F＞G＞E＞A＞H＞B＞D，也就是說，升溫速率1(V1)對(duì)桉葉提取物中脂肪酸粗脂檢測(cè)影響最大，其次是升溫速率2(V2)、最后溫度Tf、第二次保留時(shí)間(t2)、初始溫度(T0)、最后保留時(shí)間、第一次保留時(shí)間、中間溫度。在因子主效應(yīng)中，除因子C起到正向效應(yīng)外，其他的均為反向效應(yīng)，即隨著因子增大Y1相應(yīng)減少。除此之外，因子 BC、BF、BH、CH、EF之間均存在著明顯的交互作用。

2.2 脂肪酸成分分析

對(duì)尾巨桉DH32-29無性系桉葉粗脂進(jìn)行GC-MS處理分析(圖1B)，除沒有實(shí)施的處理號(hào)，共分離出脂肪酸(十四酸、棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸、硬脂酸、花生酸、二十二酸、二十四酸、二十六酸、二十八酸)甲脂產(chǎn)物10個(gè)峰，平均獲得檢測(cè)出5種脂肪酸，其中處理號(hào)11和17可鑒定10種脂肪酸。因此不同的處理組合之間差異較大，對(duì)脂肪酸成分含量來說是顯著性的。對(duì)脂肪酸種類數(shù)與各影響因子進(jìn)行建模分析，得到有效Y2回歸模型方程(R2=0.881，p=2.3×10-3)如下:

從(2)式可知，對(duì)于脂肪酸成分種類數(shù)(Y2)，因子C(升溫速率1)是最主要的影響因子，其次為因子E(第二次保留時(shí)間t2)，影響均達(dá)到極顯著水平。因子 BC、BD、BH、CF、DH、EF 均存在著明顯的因子交互影響。

2.3 脂肪酸成分的Simpson指數(shù)

Simpson指數(shù)為描述分類變量總體多樣性大小的指數(shù)，多用于群體多樣性計(jì)算，其公式為:D=1-ΣPi2(式中Pi種的個(gè)體數(shù)占群體中總個(gè)體數(shù)的比例)，反映了一個(gè)群體的優(yōu)異性，當(dāng)總體的分類數(shù)增多時(shí)，相應(yīng)的多樣度增大，本實(shí)驗(yàn)以此分析脂肪酸成分的差異。分別以脂肪酸不同種類以及相對(duì)含量，計(jì)算脂肪酸成分的Simpson指數(shù)(Y3)，結(jié)果如圖1C。

大部分處理號(hào)的Simpson指數(shù)分別在0.4左右(平均值為0.3790±0.039)，不能實(shí)施的處理號(hào)(19、28、29、31、37、46、48、52)的 Simpson 指數(shù)為最大值1，而處理號(hào)32最小(0.02)。

從式(3)可知，對(duì)脂肪酸成分Simpson指數(shù)(Y3)影響比較大的主效應(yīng)因子為F、G、C，在交互作用中影響的因子分別為AE、BF、CH。

2.4 譜圖質(zhì)量(Y4)

根據(jù)不同處理的脂肪酸離子流色譜圖進(jìn)行峰的分離度、分布的評(píng)估，結(jié)果如圖1D。離子譜圖質(zhì)量(Y4)除了處理號(hào) 19、28、29、31、37、46、48、52 為 0外，大部分處理號(hào)平均Y4為2級(jí)，只有處理號(hào)1、7、43達(dá)到3級(jí)。對(duì)Y4影響因子進(jìn)行逐步回歸分析(stepwise regression)，得到有效Y4平方根的回歸模型方程(R2=0.710，p＜1.0×10-4)。

從式(4)可知，因子C、G、E是影響Y4的重要的因子，其中升溫速率(C)的影響最大。

2.5 桉葉脂肪酸最優(yōu)GC－MS條件確定

先由桉葉脂肪酸含量、成分種類數(shù)、脂肪酸成分的Simpson指數(shù)以及GC-MS離子流色譜圖質(zhì)量4個(gè)指標(biāo)按照等比權(quán)重和脂肪酸成分種類數(shù)越大、Simpson指數(shù)越小，譜圖質(zhì)量等級(jí)越高的要求構(gòu)建桉葉脂肪酸GC-MS綜合指標(biāo)，在上述分析以及擬合模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行RSM優(yōu)化分析，最后獲得最優(yōu)因子組合期望值較高的為10個(gè)(表3)。從優(yōu)化的結(jié)果來看，在優(yōu)化方案1中GC-MS條件下，理論上可以獲得脂肪酸成分的相對(duì)含量86.9%、可檢測(cè)脂肪酸成分為8種(Y2)、Simpson指數(shù)為0.16，離子流譜圖質(zhì)量為2.4等級(jí)。分別以兩種方法(優(yōu)化前的常規(guī)參數(shù)和獲得最優(yōu)化參數(shù))對(duì)16個(gè)不同提取方法獲得尾赤桉WC3桉葉提取物進(jìn)行驗(yàn)證分析比較(表3)，結(jié)果表明在優(yōu)化獲得的參數(shù)下，桉葉脂肪酸含量、成分種類數(shù)、脂肪酸成分的Simpson指數(shù)上均顯著優(yōu)于優(yōu)化前常規(guī)參數(shù)條件，能獲得滿意的結(jié)果(如圖2)。

表3 桉葉脂肪酸分析GC-MS優(yōu)選組合以及驗(yàn)證比較Table 3 The optimum GC-MS conditions for fatty acids analysis of Eucalyptus leaf and the tested resluts

圖2 在優(yōu)化GC-MS條件下尾赤桉WC3桉葉提取物離子圖Fig.2 TIC of the fatty acid in E.urophylla×E.camaldulensis WC3cloneleaves

3 結(jié)論

3.1 以超聲波法對(duì)尾巨桉葉脂肪酸成分時(shí)，檢測(cè)所得的桉葉脂肪酸相對(duì)含量比較高(到達(dá)72.3%)，脂肪酸成分種類平均可檢測(cè)出5種脂肪酸，最大可以可獲得10種脂肪酸成分，這與以前報(bào)道的一致［11］，即桉葉中脂肪酸含量豐富。

3.2 GC-MS色譜條件對(duì)脂肪酸分析檢測(cè)影響顯著。程序升溫中的升溫速率對(duì)脂肪酸成分分離起到關(guān)鍵性的作用，不但影響分離快慢，也直接影響分離好壞。從本研究結(jié)果表明，對(duì)尾巨桉葉片脂肪酸成分檢測(cè)影響最大的因素是升溫速率V1。

3.3 通過D-optimal響應(yīng)面法對(duì)色譜條件重要因子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，共設(shè)計(jì)處理組合55個(gè)，盡管其中有8個(gè)不能實(shí)施的處理組合，但因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)中考慮到這點(diǎn)(其中5個(gè)為防缺失處理組合，5個(gè)為重復(fù)處理組合)，因此所獲得的回歸模型均有效。最優(yōu)GC-MS色譜條件為:初始溫度(80℃)、第一次保留時(shí)間(1.1min)、升溫速率1(17℃/min)、中間溫度(240℃)、第二次保留時(shí)間(0.7min)、升溫速率2(1℃/min)、最后溫度(253℃)、最后保留時(shí)間(4min)。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明所獲結(jié)果可行。

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