響應面法優化新疆脹果甘草多糖的提取工藝

劉文玉，顏雪琴，林祥群，魏長慶

(1.新疆石河子職業技術學院，新疆石河子832000;2.石河子大學食品學院，新疆石河子832000)

甘草(Glycyrrhiza spp.)為豆科甘草屬多年生草本植物，是新疆荒漠區最主要的植被物種之一，分布面積廣、貯量大，其性甘、平，具有清熱解毒、健脾補氣、潤肺止咳之功效，民間用于治療乳腺炎、胃及十二指腸潰瘍、慢性氣管炎、咳嗽、氣喘、慢性咽喉炎、食物中毒等癥［1］。甘草多糖(GPS)為甘草重要的活性成分之一［2］，具有抗補體和促有絲分裂等免疫調節作用［3］，尤其是免疫活性、抗氧化活性以及抗腫瘤活性都與其含量密切相關［4］。新疆甘草中以脹果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)資源最豐富，產量居全國之冠，是新疆商品甘草的最主要來源，主要分布在新疆天山以南的和田、喀什、阿克蘇、巴音郭楞和哈密等地。2008年兵團農三師獲得國家農業開發土地治理項目“新疆生產建設兵團農業三師1萬hm2人工甘草基地”建設項目，至2011年甘草人工種植甘草面積已經達到1萬 hm2［5-7］。目前，甘草多糖的研究報道較多，而針對采用響應面優化方法研究新疆脹果甘草多糖的研究報道較少。張琳［8］、趙春建等［9］、王航宇［10］等研究超聲波提取溫度、提取時間、液固比等因素對甘草多糖提取率的影響，并優化了提取條件。因此，通過對脹果甘草多糖的提取尋找新的具有高活性的甘草多糖仍然是多糖研究領域的一大重點和熱點課題［11］。本實驗以新疆脹果甘草多糖提取率為響應值，在單因素實驗基礎上，進行提取溫度、提取時間和料液比的中心組合實驗，擬合出多元線性回歸方程，以獲得新疆脹果甘草多糖提取的最佳工藝及其參數，為脹果甘草多糖的提取加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新疆脹果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)購于新疆石河子市農貿市場;無水乙醇、石油醚、硫酸、苯酚、葡萄糖等 均為分析純。

MNMF-1818型谷物粉碎機 湖北碧山機械有限公司;T6型紫外可見分光光度計 湘儀集團;RE52-2旋轉蒸發器 上海滬西分析儀器廠有限公司;722型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;FA1004A電子天平 上海精天電子儀器有限公司;微量加樣器 上海大龍醫療設備有限公司;SSY型電熱恒溫水浴鍋 北京泰克儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基本工藝流程

1.2.1.1 粉碎、脫脂 甘草干品粉碎后過40目篩，按料液比1∶5(g∶mL)用石油醚回流脫脂1h，重復1次。

1.2.1.2 脫糖 將脫脂后的甘草粉末自然風干后，按料液比1∶5用80%乙醇溶液回流2h，重復1次，濾渣60℃烘干，蒸餾水90℃水提2h，將每次提取過濾所得的水提母液合并，濃縮至合適體積，使用玻璃透析袋流水透析3d。

1.2.1.3 脫蛋白 將濃縮液用15%三氯乙酸在4℃下攪拌脫蛋白。溶液經離心去沉淀，清液以1mol/L NaOH中和至中性，再流水透析3d。

1.2.1.4 濃縮 袋內溶液濃縮至適當體積，加入4倍于糖溶液體積的80%乙醇在4℃過夜沉淀并用80%乙醇清洗。

1.2.1.5 收集沉淀 離心收集沉淀，經乙醇和無水丙酮依次洗滌三次后冷凍干燥得到粗多糖。

1.2.2 脹果甘草多糖含量測定方法 采用苯酚硫酸法，參照參考文獻［4-5］。

1.2.4 葡萄糖標準曲線的繪制 精確量取葡萄糖標準品溶液 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL，置于標有 1、2、3、4、5號的干燥試管中并加水至2.0mL，再加入5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，然后加濃硫酸(95.5%)5.0mL，充分搖勻，放置10min，沸水浴20min，同時設蒸餾水為空白對照，以上述確定波長進行掃描測定，測定其吸光度值，以濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.5 甘草多糖提取條件的確定 依據參考資料［2，5，10］，取 過 40 目 篩 的 甘 草 粉 末 1g，提 取 時 間60min、料液比為 10∶1(mg∶L)、提取溫度為 80℃為初始工藝參數，考察料液比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)、提取時間(30、50、70、90、110min)、提取溫度(50、60、70、80、90、100℃)對脹果甘草多糖提取率的影響。

1.2.6 中心組合實驗 在單因素實驗基礎上，選取料液比、提取時間和提取溫度進行中心組合實驗，并結合實際實驗條件選取合理水平。以多糖提取率(Y)為響應值，并與建立的回歸方程給出的預測值(Y＇)比較，通過響應面分析及對提取條件進行優化。中心組合實驗因素與水平設計如表1所示。

表1 中心組合設計因素與水平表Table 1 Factors and levels in the central composite design

2 結果與討論

2.1 葡萄糖標準曲線

葡萄糖的波長掃描圖見圖1。以λmax=475nm作為甘草多糖的最大吸收波長。在λmax=475nm處測定標準曲線，回歸方程為y=0.0465x-0.007(R2=0.9992)的葡萄糖標準曲線見圖2。

圖1 葡萄糖的波長掃描圖Fig.1 Scan map of glucose wave length

圖2 葡萄糖標準曲線Fig.2 Standard curve of glucose

2.2 不同因素對脹果甘草多糖提取率的影響

提取時間對甘草多糖提取效果的影響如圖3所示。在提取時間為70～90min時提取率較高，超過90min，脹果甘草提取率有所下降，考慮到浸提時間過長，有可能引起提取物結構的變化，同時可能會產生副產物，影響其功能性質，因此，選擇提取時間75min，進行下一步實驗;提取溫度對甘草多糖提取效果的影響如圖4所示，提取溫度由50℃增加到90℃時，脹果甘草多糖提取隨溫度的上升而上升，當溫度超過90℃后繼續提高溫度提取率變化不大，因此，選擇90℃進行下一步實驗;不同料液比對甘草多糖提取效果的影響如圖5所示，脹果甘草多糖提取率隨料液比的增大而增加，當料液比大于20∶1時，提取率不再增加，因此，選擇料液比為20∶1進行下一步實驗。

2.3 中心組合實驗

圖3 提取時間對甘草多糖提取率的影響Fig.3 Effect of time on extraction

圖4 提取溫度對甘草多糖提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction

圖5 料液比對甘草多糖提取率的影響Fig.5 Effect of ratio of solid to liquid on extraction

響應面設計的Box-Benhnken法具有實驗次數少、精度高、預測性好等優點，常用于因素水平的優化。依據單因素實驗結果，以料液比、提取時間和提取溫度作為主要因素，設計三因素三水平響應面分析實驗。共有15個實驗點，其中12個為析因子，3個為零點。零點實驗進行3次，以估計誤差。中心組合實驗方案及結果如表2所示。

表2 中心組合實驗方案及結果Table 2 Central composite design matrix and experimental results

以脹果甘草多糖提取率為響應值，通過SAS統計軟件的響應面回歸方程對表2數據進行方差分析(表3)，建立多糖提取率(Y)的二次響應面回歸模型，回歸方程為:

回歸方程的相關系數R2=0.9854，模型與實際擬合較好。模型的F值為37.54，p＜0.01，說明回歸模型方程顯著;CV值僅為0.57，說明實驗操作可信。綜上所述，此回歸方程可用于脹果甘草多糖提取率的預測。

根據回歸方程，分別繪制其中一個因素固定于零水平的條件下另外兩個因素之間的響應曲面圖，如圖6所示。

表3 多糖提取率的二次多項回歸模型方程方差分析Table 3 Analysis of variances for the established Radix Glycyrrhiza ploysacchride yield

圖6 各因素對甘草多糖提取率影響的響應面圖Fig.6 Response surface plots for polysaccharide extraction ratio in the function of different parameters

2.4 最佳提取條件及實驗模型的驗證

通過軟件分析得到的最大的響應值為10.59%，即脹果甘草多糖最大提取率為10.59%，與之對應的提取條件為:溫度 92.4℃，時間 83.3min，料液比20.8∶1。考慮到實際操作的便利性，采用溫度93℃，時間83min，料液比為21∶1為優化條件，進行3組重復實驗。結果表明:模型得到最優條件下脹果甘草多糖實際平均提取率為10.48%，與預測的理論值相接近，說明模型有效且能夠較好地反映出脹果干草多糖的提取條件，同時也說明了用響應面法優化脹果甘草多糖的提取條件是可行的。本實驗所提取脹果甘草多糖主要為粗多糖，經測算其純度為34.96%，與張琳［8］等提取的甘草多糖的純度相比純度較低，主要可能與甘草品種的不同有關，另外本實驗未采用超聲輔助提取也會對脹果甘草多糖的提取率及純度產生影響，因此后續實驗需要進一步純化，并且考慮采用其他方式如超聲波、微波輔助提取，以期提高脹果甘草多糖提取率及純度。

3 結論

在單因素實驗設計的基礎上，對新疆脹果甘草多糖的提取條件進行了三因素三水平的響應面設計，建立了響應值和各個因素之間的數學模型，依據此數學模型確定的最佳提取工藝為溫度93℃，時間83min，料液比21∶1。在上述最佳提取條件下，脹果甘草多糖提取率的實驗值為10.48%。模型方差分析和響應面的分析表明，該模型回歸極顯著，對實驗擬合較好，對油新疆脹果甘草多糖提取的工業化有一定應用價值。

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