響應面法超聲波輔助提取雙孢蘑菇蛋白工藝優化

馬澤青，張寶善，趙舒欣，張云濤

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安710062)

雙孢蘑菇［Agaricus bisporus(Lange)Sing.］俗稱蘑菇、紐扣菇、白蘑菇或雙孢菇，隸屬于傘菌目(Agaricales)蘑菇科(Agaricacese)蘑菇屬(Agaricus)。雙孢菇蛋白質含量居食用菌之首，每100g干菇蛋白質在38～40g之間，雙孢蘑菇中含有豐富的氨基酸，其含有的18種氨基酸中8種為人體必需氨基酸，包含在一般植物蛋白中缺乏的色氨酸和賴氨酸，必需氨基酸占總氨基酸的達40%，支鏈氨基酸比例也較高，芳香族氨基酸的比例較低［1］。近年來對食用菌的研究多在進行多糖等生物活性物質的提取［2-5］，食用菌中其他成分的功能性質研究相對較少。研究表明，一些食用兼藥用真菌中的蛋白質和肽類可作為降血壓功能食品進行開發［6］，因此研究開發提取食用菌中這些組分顯得尤其有意義。本文采用超聲波輔助水提雙孢蘑菇蛋白，可利用超聲空化作用而粉碎植物細胞、釋放內容物，從而克服水提法時間長、效率低等缺點［7-8］。實驗采取單因素實驗和響應面法，以雙孢蘑菇蛋白質提取率為指標，對影響超聲波輔助水提雙孢蘑菇蛋白的一些重要因素進行研究，以期為提高雙孢蘑菇蛋白質的提取率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙孢蘑菇子實體 購于西安市朱雀農產品交易市場;牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250、檸檬酸、氯化鈉、抗壞血酸、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、無水乙醇、苯酚、濃硫酸 均為分析純。

高功率數控超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司;TDL-4離心機 上海安亭科學儀器廠;PL203型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;WFJ2000型可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;Kjeltec 2300型全自動凱氏定氮儀 瑞典福斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雙孢蘑菇蛋白質的提取工藝流程

1.2.1.1 原料 選擇成熟適當，色澤潔白，菇形飽滿圓整，新鮮無異味，無蟲蛀，無銹病，無機械損傷，無雜質的菇體，購置后立即存放于4℃冰箱中保存。

1.2.1.2 護色 將雙孢蘑菇浸泡在護色液中進行護色，護色液中添加0.6%檸檬酸、0.3%氯化鈉和0.05%抗壞血酸［9］。

1.2.1.3 打漿 蘑菇切碎，加入一倍重量的水，打漿機打碎3～4min。

1.2.1.4 超聲處理 蘑菇漿液按不同比例加水，用不同的超聲溫度、超聲時間、超聲功率提取雙孢蘑菇多糖。

1.2.1.5 離心 先用200目尼龍網粗濾提取液，再利用離心機(3000r/min)離心蘑菇渣汁以進一步提取汁液。

1.2.2 蛋白質提取率測定方法

1.2.2.1 雙孢蘑菇粗蛋白含量測定 參考GB/T 14771-1993。取待測樣 1mL，加入 CuSO4·5H2O 0.7179g、K2SO46.2821g和濃硫酸12mL，于420℃消化1h，溶液澄清透亮時取出，冷卻至室溫待測。定氮系統HCl濃度為0.107mol/L。

1.2.2.2 雙孢蘑菇提取液水溶性蛋白含量測定 超聲提取離心后上清液的蛋白質含量用考馬斯亮藍比色法測定。以牛血清蛋白(BSA)為標準品，于595nm波長處測定吸光度，繪制蛋白質標準曲線如圖1所示，建立回歸方程為y=0.004x+0.006，其中y為吸光度，x為蛋白質濃度(μg/mL)，R2=0.999。

圖1 蛋白含量標準曲線Fig.1 The standard curve of protein content

1.2.2.3 雙孢蘑菇蛋白提取率計算 蛋白提取率(PE，%)=提取液蛋白質含量/原料粗蛋白×100

1.2.3 提取工藝

1.2.3.1 單因素實驗 稱取雙孢蘑菇漿液10.00g，以超聲功率(80、120、160、200W)、料液比(1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7)、超聲時間(10、20、30、40、50min)、超聲溫度(30、40、50、60、70℃)作為單因素實驗條件進行超聲波提取雙孢蘑菇蛋白，超聲提取后將上清液離心，測定上清液中蛋白質含量。

1.2.3.2 響應面優化實驗 在單因素實驗的基礎上，綜合考慮各因素對雙孢蘑菇中蛋白質提取率的影響，采用統計分析軟件建立四因素三水平的Box-Behnken模型，確定最優提取工藝。以雙孢蘑菇蛋白質的提取率PE為響應值，提取溫度(X1)、料液比(X2)、超聲功率(X3)、超聲時間(X4)為自變量，變量因素編碼及水平見表1。

表1 超聲法自變量因素編碼及水平Table 1 Factors and levels in response surface test

1.2.4 數據分析方法 所有實驗均進行3次重復，采用統計分析軟件Design-Expert 7.0對數據進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 超聲功率對雙孢蘑菇蛋白質提取的影響 料液比為1∶3，超聲溫度為50℃，超聲時間為20min，超聲功率對雙孢蘑菇風味物提取的影響結果如圖2所示。

圖2 超聲功率對雙孢蘑菇蛋白質提取率的影響Fig.2 Influence of ultrasonic power on Agaricus bisporus protein extraction rate

從圖2可以看出，隨著超聲功率的增加，超聲對細胞破壁作用增強，雙孢蘑菇中水溶性蛋白的溶出也逐漸增大，PE逐漸提高。超聲功率為120W時，PE值達到最大而后趨于穩定，因此選取80、120、160W繼續對雙孢蘑菇蛋白的提取做響應面分析以確定最佳超聲功率。

2.1.2 超聲溫度對雙孢蘑菇蛋白質提取的影響 料液比為1∶3，超聲功率為120W，超聲時間為20min，超聲溫度對雙孢蘑菇蛋白質提取的影響結果如圖3所示。

圖3 超聲溫度對雙孢蘑菇蛋白質提取率的影響Fig.3 Influence of ultrasonic temperature on Agaricus bisporus protein extraction rate

從圖3可以看出，PE隨著超聲溫度的增加而增大，在50℃時達到最大;此后，溫度上升PE反而呈下降趨勢。在溫度相對較低的情況下，超聲空化作用能促使蠶豆組織中蛋白最大限度溶出;當溫度超過50℃后，高溫會導致雙孢蘑菇蛋白變性，降低酸沉率，從而使提取率下降。因此，選取40、50、60℃繼續對雙孢蘑菇蛋白的提取做響應面分析以確定最佳超聲溫度。

2.1.3 超聲時間對雙孢蘑菇蛋白質提取的影響 在料液比為1∶3，超聲溫度為50℃，功率為120W，超聲時間對雙孢蘑菇蛋白質提取的影響結果如圖4所示。

圖4 超聲時間對雙孢蘑菇蛋白質提取率的影響Fig.4 Influence of ultrasonic time on Agaricus bisporus protein extraction rate

從圖4中可以看出，PE隨著超聲時間的延長而增大。PE在超聲前10～20min迅速增加，20～40min變化不大，40～50min下降，主要因為超聲空化作用能使雙孢蘑菇蛋白在較短時間內最大限度溶出，之后提取率不再隨時間的延長而增加，反而因長時間超聲空化作用導致蛋白變性，使提取率呈下降趨勢。因此，選取20、30、40min繼續對雙孢蘑菇蛋白的提取做響應面分析以確定最佳超聲時間。

2.1.4 料液比對雙孢蘑菇蛋白質提取的影響 超聲溫度為50℃，超聲功率為120W，超聲時間為30min，料液比對雙孢蘑菇蛋白提取的影響結果如圖5所示。

圖5 料液比對雙孢蘑菇蛋白質提取率的影響Fig.5 Influence of the material liquid ratio on Agaricus bisporus protein extraction rate

從圖5可以看出，PE隨著料液比的增大變化不大，綜合考慮蛋白質提取率、加工成本及后續加工中濃縮工藝的需要，因此選取料液比 1∶3、1∶4、1∶5 繼續對雙孢蘑菇蛋白的提取做響應面分析以確定最佳料液比。

2.2 中心組合實驗設計結果分析

響應面實驗結果見表2，對實驗數據進行回歸擬合后，得到回歸方程為:

表2 工藝參數響應面實驗設計與結果Table 2 Design and results in response surface test of process parameters

表3為回歸模型方差分析結果，回歸方差分析顯著性檢驗表明，該模型回歸顯著(p＜0.0001)，失擬項不顯著，并且該模型=0.9941，說明該模型與實際實驗擬合較好，能解釋99.41%響應值的變化，僅有0.59%不能用該模型來解釋;預測值與實測值之間有較好的相關性，實驗誤差小，自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于雙孢蘑菇蛋白提取工藝實驗的分析和預測。

由表3方差分析結果可知，提取溫度、超聲功率和超聲時間3個因素在實驗過程中均起主要作用，對方程影響顯著程度由大到小依次為超聲功率、超聲溫度、超聲時間和料液比，超聲溫度和超聲功率對方程影響最顯著，說明這二者直接關系蛋白質提取率的大小，而料液比的影響對蛋白質提取率的影響不顯著。項影響極顯著;項對模型的影響高度顯著;X4、交互項X1X3對提取率的影響也達到了顯著水平，表明各因素之間不是簡單的線性關系，而是二次關系。

2.3 響應面結果分析

響應面分析結果如圖6～圖11。響應面圖形是特定的響應值 PE與因素 X1、X2、X3、X4構成的三維空間在二維平面上的等高圖。在每個響應面曲線中對2個因素進行分析，另外2個因素固定在零水平，可以直觀地反映各因素的交互作用以及對響應值的影響。從圖中可看出擬合曲面有最大值，對擬合方程求偏導，可得出模型最大值，即為最優的實驗方案。

表3 蛋白質提取率回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance to the rate of protein extraction

圖6 溫度與料液比互作用等高線和響應面圖Fig.6 Respanse surface chart of temperature and solid to liquid ratio

圖7 料液比與超聲功率互作用等高線和響應面圖Fig.7 Response surface chart of solid to liquid ratio and ultrasonic power

圖6～圖11中幾個曲面圖的極值點不明顯，但可以較直觀地看出實驗設計的各個因素及其交互作用對雙孢蘑菇蛋白提取率的影響，具有一定參考價值。

圖8 溫度與超聲功率互作用等高線和響應面圖Fig.8 Response surface chart of temperature and ultrasonic power

圖9 溫度與超聲時間互作用等高線和響應面圖Fig.9 Response surface chart of temperature and ultrasonic time

圖6～圖7表明料液比對雙孢蘑菇蛋白提取率影響顯著性不大，而超聲溫度和超聲功率對提取率的影響較為顯著，過高或過低的超聲溫度和超聲功率都會使雙孢蘑菇蛋白提取率降低，其中超聲功率的影響更為顯著，超聲溫度和超聲功率存在最適值。圖8～圖10中等高線呈橢圓形，表示提取溫度和超聲功率兩因素之間交互作用顯著，相比較下，其他因素間交互作用較小。圖11表明超聲時間和料液比對雙孢蘑菇蛋白提取率影響均不太顯著，與方差分析結果相吻合。

2.4 響應面結果驗證實驗

圖10 超聲功率與超聲時間互作用等高線和響應面圖Fig.10 Response surface chart of ultrasonic time and ultrasonic power

圖11 料液比與超聲時間互作用等高線和響應面圖Fig.11 Response surface chart of solid to liquid ratio and ultrasonic time

由模型方程計算可得，最優提取方案為超聲功率130W，提取溫度43.1℃，超聲時間39.7min，料液比1∶5，雙孢蘑菇蛋白理論最大得率為50.54%。根據實驗情況將以上條件調整為提取溫度43℃、料液比1∶5、超聲功率 130W、提取時間 40min，重復 3 次實驗，蛋白質平均得率為50.39%，與模型方程預測值基本一致。結果表明，該模型可以較好地反映出雙孢蘑菇蛋白提取的條件，從而也證明了響應曲面法優化提取雙孢蘑菇蛋白條件參數的可行性。

3 結論

通過單因素實驗和響應面法優化超聲波輔助提取雙孢蘑菇蛋白實驗，得到二次多項式回歸模型(R2=0.9973)，探討各因素間的交互作用，并對實驗結果進行數學模擬和預測。最終確定了超聲波輔助提取雙孢蘑菇蛋白質的最佳工藝參數為超聲功率130W，提取溫度43℃，超聲時間40min，料液比1∶5，雙孢蘑菇蛋白提取率可達50.39%。

［1］吳素玲，孫曉明，王波，等.雙孢蘑菇子實體營養成分分析［J］.中國野生植物資源，2006，25(2):47-48，52.

［2］徐朝暉，姜世明，付培武.雙孢蘑菇子實體多糖的提取及其對癌細胞的抑制［J］.中國食用菌，1997，16(4):5-7.

［3］李鳳林，李應華.超聲波法提取白靈菇多糖的工藝研究［J］.食用菌，2009(3):74-75.

［4］羅袆，李東.香菇多糖的研究進展［J］.食品與發酵工業，2000，26(4):63-67.

［5］賴小玲，鄭秀玲，鄭浩文.超聲波法提取茶薪菇粗多糖的工藝［J］.食品與發酵工業，2007，33(6):145-147.

［6］李桂峰，王向東，趙國建，等.酶解雙孢菇蛋白制備抗氧化肽的研究［J］.中國食品學報，2001(5):38-43.

［7］楊景峰，羅志剛，羅發興.物理波在真菌多糖提取中的應用［J］.糧油食品科技，2007，15(5):56-58.

［8］張玉祥，邱蔚芬.銀杏葉超聲波提取工藝研究［J］.時珍國醫國藥，2006，17(5):784-785.

［9］鄒偉.雙孢蘑菇風味料加工工藝研究［D］.西安:陜西師范大學，2011.