乳腺癌組織中NHERF1、PTEN和ERα蛋白的表達及其臨床意義

李 陽 李 洋 程 杉 葛志成 司 楊 賀俊崎*

(1.首都醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系，北京100069;2.首都醫科大學附屬友誼醫院普外科，北京100050)

乳腺癌是一種異質性很高的惡性腫瘤，近年來，腫瘤相關基因表達的變化在腫瘤的發生、發展及轉移中的作用已引起廣泛重視。鈉氫交換子調節因子1(Na+/H+exchanger regulatory factor 1，NHERF1)是新發現的乳腺癌抑制基因［1］。PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosometen)是被發現的第1個具有磷酸酶活性的抑癌基因［2］，可參與細胞周期的調控、促進凋亡和抑制腫瘤的發生。雌激素受體(estrogen receptor，ER)不僅存在于乳腺、子宮等雌激素靶組織，在肺癌等多種非雌激素靶器官組織中也廣泛存在［3］。有文獻［4］報道，NHERF1 介導雌激素受體調節PTEN蛋白的表達，影響了PTEN相關的信號轉導通路，進而影響了乳腺癌的惡性表型。我們采用免疫組織化學方法研究了NHERF、PTEN和雌激素受體亞型ERα蛋白在乳腺癌和癌旁組織中的表達情況，以期在臨床水平探討NHERF1、PTEN和ERα蛋白在乳腺癌發生中的作用、相互關系及其臨床意義，為揭示NHERF1通過調節PTEN表達而影響乳腺癌發展的機制提供臨床依據。

1 材料與方法

1.1 標本

選取2008年1月至2009年12月首都醫科大學宣武醫院手術獲取的乳腺癌標本4例，患者全部為女性，術前未進行化療和放療。采取4例患者癌旁正常組織為對照組。應用BloomRichardsen’s組織學分級，參照Elston和Ellis改良方法［5］，對4例乳腺癌組織進行分級:Ⅰ級3例，Ⅱ級1例。病理學類型均為浸潤性導管癌(非特殊型)。

1.2 方法

NHERF1鼠抗人單克隆抗體、PTEN鼠抗人單克隆抗體、ERα鼠抗人單克隆抗體(美國Santa Cruz公司產品)，S-P免疫組化試劑盒、液體DAB酶底物顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。免疫組化染色SP法，微波抗原修復，按試劑盒說明操作，蘇木素襯染。

1.3 結果判定

NHERF1陽性細胞為棕黃色或黃色顆粒位于導管上皮細胞，而只出現于脂肪組織內判定為非特異性染色;PTEN、ERα陽性細胞為棕黃色或黃色顆粒位于細胞質或膜。在癌組織以及癌旁組織隨機選擇5個高倍鏡視野，計數100個細胞中染色陽性細胞的灰度值，并計算癌組織與癌旁組織的灰度值的平均值及標準差，應用雙側t檢驗，通過P值大小檢驗癌組織與癌旁組織表達量差異是否有統計學意義。

1.4 統計學方法

采用SPSS 10.0進行統計學分析，計量資料用均數±標準差(±s)表示，組間比較采用配對t檢驗，等級資料的相關性采用Spearman相關系數rs描寫。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NHERF1在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達

4例乳腺癌組織中NHERF1表達量的平均灰度值為201.47;而對應癌旁組織中NHERF1表達量的平均灰度值為477.65，通過配對t檢驗，差異有統計學意義(P＜0.01)(圖1)。

圖1 NHERF1蛋白在乳腺癌及癌旁組織中表達量分析Fig.1 NHERF1 expression in breast cancer

2.2 PTEN在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達

4例乳腺癌組織中PTEN表達量的平均灰度值為179.23;而對應癌旁組織中PTEN表達量的平均灰度值為373.34，通過配對t檢驗，差異有統計學意義(P＜0.01)(圖2)。

圖2 PTEN蛋白在乳腺癌及癌旁組織中表達量分析Fig.2 PTEN expression in breast cancer

2.3 ERα在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達

4例乳腺癌組織中ERα表達量的平均灰度值為389.47;而對應癌旁組織中ERα表達量的平均灰度值為177.12，通過配對t檢驗，差異有統計學意義(P＜0.01)(圖3)。

圖3 ERα蛋白在乳腺癌及癌旁組織中表達量分析Fig.3 ERα expression in breast cancer

2.4 乳腺癌組織中NHERF1蛋白表達與PTEN表達的關系

通過Spearman等級相關檢驗NHERF1的表達與PTEN的表達呈正相關(rs=0.611，P＜0.01)。

3 討論

多數乳腺組織中ERα為激素調節轉錄子，介導細胞激素反應。雌激素與其受體結合，促進新的蛋白的合成，其中包括孕激素受體的合成，其調節乳腺細胞的生長、分化，是乳腺癌的生物學標志之一。本研究中結果顯示，ERα在乳腺癌組織表達顯著高于正常乳腺組織，提示ERα的高表達可能參與了乳腺癌的發生發展過程。

大量研究［6］結果顯示，NHERF1有調節細胞增生的潛在功能。在30%的乳腺癌細胞中發現NHERF-1表達下調，腫瘤的發生可能是由于NHERF1蛋白表達水平較低或消失，使其抑癌作用減弱或消失而導致。抑制乳腺癌細胞T47D或MCF7中內源表達的NHERF-1后，細胞增生能力增強，對裸鼠的致瘤能力也增強。抑制NHERF-1表達后，細胞從G1到S期進展加快，伴隨cyclin E表達增加和Rb磷酸化水平升高。由此推測，正常NHERF1在乳腺上皮細胞中的功能是阻止細胞周期進展。NHERF1對細胞周期的調節作用與它在乳腺中的腫瘤抑制活性相關［7］。本研究結果顯示，NHERF1在乳腺癌組織表達顯著低于正常乳腺組織，提示NHERF1可能參與了乳腺癌的發生發展過程。雌激素受體ERα作為NHERF1的轉錄調控因子能夠調控NHERF1 mRNA的表達，雌激素能夠通過ERα誘導細胞內NHERF1的表達［8］，但是在本研究中發現，在 ERα高表達的乳腺癌組織中NHERF1低表達，可見，腫瘤組織中NHERF1表達異常，腫瘤組織中NHERF1的表達很可能受到多種因素的調節，并且與腫瘤的發生、發展相關。

PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosometen)是1997年發現的一個具有雙磷酸酶活性的抑癌基因［9-10］，它在細胞的生長、增生、分化、凋亡、黏附、遷移和血管生長等多種生命活動過程中起重要的調節作用。PTEN功能的異常可以引發多種腫瘤。PTEN基因的缺失以及體細胞性突變經常發生于膠質細胞瘤、子宮內膜癌、前列腺癌以及小細胞肺癌中［11］。有研究［4］表明，NHERF1 通過 PDZ-I結構域與抑癌蛋白PTEN有相互作用，并且可提高細胞內PTEN的蛋白表達量，而其mRNA表達水平沒有增加;利用環己酮抑制新蛋白合成后，檢測到NHERF-1的表達可以抑制PTEN蛋白的降解速度，說明NHERF1能夠在蛋白水平促進PTEN蛋白的穩定性。本研究對10例乳腺癌組織標本及癌旁正常組織中PTEN蛋白檢測結果顯示，PTEN蛋白在乳腺癌組織中表達顯著低于正常乳腺組織，并且NHERF1的表達與PTEN的表達呈顯著正相關(r=0.611，P＜0.01)。由此可見，乳腺癌組織中PTEN蛋白表達高低與NHERF1的表達情況有很大的關系。NHERF1很可能通過對PTEN蛋白穩定性的作用，影響了PTEN相關的信號轉導通路，進而影響了乳腺癌的惡性表型。

許多學者［12-13］認為，在惡性腫瘤發生、發展和轉移的各階段，至少有2個或2個以上功能不同，異常激活的基因各自發生作用，促進了細胞的癌變［12］。本課題組研究了乳腺浸潤性導管癌中 NHERF1、PTEN、ERα在乳腺癌的表達情況及其相互關系，研究結果顯示NHERF1和PTEN的表達呈正相關，在腫瘤組織中NHERF1表達量降低，PTEN的表達也會下降，很可能是由于NHERF1的表達影響了PTEN蛋白的表達及穩定性，從而影響了PTEN在乳腺癌組織中的蛋白水平，進而調節了乳腺癌的發生發展，表明在腫瘤細胞的增生侵襲過程中，多種因子相互作用，參與腫瘤生成發展的多個環節。

綜上所述，乳腺浸潤性導管癌的發生和發展與其生物學特征的分布有一定規律可循，聯合檢測NHERF1、PTEN可作為制定綜合治療方案的依據，用來指導臨床用藥和判斷預后。

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