臍帶間充質干細胞染色體核型制備及安全評估

張立新，陳亞寶，葉 軍，李 林，林 梅，黃俊星，吳正東

(南通大學醫學院附屬泰州市人民醫院臨床醫學研究室1、腫瘤科2，江蘇 泰州 225300)

臍帶間充質干細胞染色體核型制備及安全評估

張立新1，陳亞寶1，葉 軍1，李 林1，林 梅1，黃俊星2，吳正東2

(南通大學醫學院附屬泰州市人民醫院臨床醫學研究室1、腫瘤科2，江蘇 泰州 225300)

目的 探討臍帶間充質干細胞染色體核型制備方法，評估臍帶間充質干細胞安全性。方法對培養至第2、5、8、10、11代的共15例臍帶間充質干細胞進行染色體制備，檢查其有無異常。結果成功制備染色體標本，成功率為100%，正常核型率為100%。結論該臍帶間充質干細胞染色體制備方法實驗結果穩定、成功率高。臍帶間充質干細胞在培養至11代時未見異常染色體核型。

臍帶間充質干細胞；染色體制備;培養

干細胞是具有自我更新能力且在適宜微環境下具有多向分化潛能的原始細胞。人類間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)可分化形成三個胚層的終末分化細胞，故被稱為“各種組織的種子細胞”，且MSC的應用避免了胚胎干細胞所帶來的倫理問題，故MSCs是目前干細胞研究中的一個重要環節。MSCs常見來源于脂肪[1]、骨髓[2]、臍血[3]，最近，關于臍帶間充質干細胞的分離培養[4]、治療應用[5-6]的研究逐漸增多。然而，有研究報道骨髓間充質干細胞在體外培養后，染色體易變性增高，并提示干細胞移植存在致瘤風險[2]，因此，間充質干細胞制品均需監測其染色體核型異常可能[3，7]，另外，由于臍帶間充質干細胞可能因胎兒遺傳學異常，存在異常染色體核型，所以，染色體核型檢查對于臍帶間充質干細胞更為重要。筆者發現各種間質干細胞染色體制備方法中條件各有不同[8-9]，而臍帶間充質干細胞染色體的制備方法報道很少。本實驗室在臍帶間充質干細胞染色體檢查中積累了一些成功經驗，在此做一總結，以供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 三份臍帶間充質干細胞培養物，由江蘇北科生物科技有限公司提供。培養至11代，選擇其中的第2、5、8、10、11代共15次標本進行染色體制備檢查。

1.2 儀器和試劑 CO2培養箱為美國Thermo公司產品。0.25%EDTA胰酶為美國GIBCO公司出品。秋水仙素制劑由青島萊佛生物工程研究所提供。貼壁培養瓶為Nunclon公司出品。

1.3 方法 每瓶中含有臍帶間充質干細胞1× 106個細胞/10 ml培養液，5%CO2，37℃培養2 d，細胞呈多角形，相互連接，基本占瓶底50%～70%(見圖1)，加入秋水仙素至0.3 μg/ml，5%CO2培養3 h后，用吸管吸去瓶中液體，加入EDTA胰酶2 ml，搖勻，靜置10～15 min，輕輕拍打瓶底，倒置顯微鏡下可見細胞呈圓形，懸浮，則加入生理鹽水10 ml混勻后，吸出加入15 ml錐底管中，離心10 min；吸除上清液，加入預溫至37℃的0.075M KCl溶液12 ml，在37℃溫箱中靜置34 min；向管中加新鮮1:3醋酸、甲醇固定液3 ml，用吸管吹打調勻，離心10 min，吸除上清液，加固定液10 ml，吹打混勻，靜置30 min，固定重復3次；最后，離心吸去上清液，0.5 ml固定液重懸細胞。4℃保存，次日進行染色體顯帶(R帶)，分析20個分裂相。

圖1 臍帶間質干細胞貼壁生長

2 結果

16份臍帶間充質干細胞培養物染色體檢查均獲得滿意的染色體分裂相，臍帶間充質干細胞分裂相形態規整，染色清晰(圖2)，染色體核型排列見圖3。成功率為100%，正常核型率為100%。

圖2 分裂相

圖3 核型排列圖

3 討論

臍帶間充質干細胞在合適的培養基中生長旺盛，一般3 d即可長滿，達到分瓶傳代要求，而培養第二天時細胞生長較為寬松，且細胞數亦較多，因此，選擇42～48 h加入秋水仙素，阻滯其分裂相停滯于中期，所得染色體分裂相分散良好；而0.3 μg/ml的秋水仙素終濃度，5%CO2培養3 h，被證實為分裂相較多，染色體長短適宜，易于分析。另外，CO2培養箱溫度波動一定要維持穩定，否則細胞生長不良，分裂相質量較差。EDTA胰酶消化后，應及時拍打，在鏡下觀察細胞形態，確保細胞均已從瓶底脫落，如仍有少量細胞貼在瓶底，可用吸管吹打至脫落。預固定時加入固定液3 ml，濃度略高，以免離心導致細胞破裂，染色體丟失。最后所制標本4℃過夜，有利于染色體分散。

由于MSCs移植可能存在致瘤風險[2]，而腫瘤的發生與細胞染色體互易、缺失、插入和倒位等為核型的異常改變關系密切[10]，因此，在美國食品藥品管理局(FDA)關于MSCs的應用程序中安全性評估提出了對MSCs染色體核型檢測的要求，同時，核型分析的異常結果比癌基因的表達特異性更高，因此在細胞治療資格認證中進行核型分析非常重要。

筆者在臍帶間充質干細胞染色體的制備、分析的過程中取得了滿意效果，同時，本研究顯示臍帶間充質干細胞在培養至11代時未見異常染色體核型，此結果可以作為臍帶間充質干細胞應用安全的重要證據。

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Preparation and safety assessment of the chromosome karyotype of umbilical mesenchymal stem cells.

ZHANG Li-xin1,CHEN Ya-bao1,YE Jun1,LI Lin1,LIN Mei1,HUANG Jun-xing2,WU Zheng-dong2.
Department of Clinical Medicine Laboratory1,Department of Oncology,People's Hospital of Taizhou City Affiliated to the Medical College of Nantong University,Taizhou 225300,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate methods for preparing chromosome karyotype of umbilical mesenchymal stem cells,and to evaluate the safeness.MethodsThe chromosomes of umbilical mesenchymal stem cell cultured for 2,5,8,10,11 generations were prepared and analyzed.ResultsThe chromosome karyotype of umbilical mesenchymal stem cell were prepared successfully,with a success rate of 100%.The rate of normal karyotype was 100%.ConclusionThe preparation method is effective and stable,with high success rate.No abnormality was found until the 11thgeneration.

Umbilical mesenchymal stem cell;Chromosome preparation;Cultivation

R392.12

A

1003—6350(2012)13—011—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.13.005

2012-02-06)

張立新(1974—)，男，江蘇省泰州市人，副主任技師，學士。