PTCL石蠟組織中HTLV-I感染情況的初步研究

凡琳琳，談 順*，饒 翔，張英愛，王識華

(中南大學湘雅海口醫院病理科1、中心實驗室2，海南 海口 570208；海南省農墾三亞醫院病理科3，海南 三亞 572000)

·論 著·

PTCL石蠟組織中HTLV-I感染情況的初步研究

凡琳琳1，談 順1*，饒 翔1，張英愛2，王識華3

(中南大學湘雅?？卺t院病理科1、中心實驗室2，海南 海口 570208；海南省農墾三亞醫院病理科3，海南 三亞 572000)

目的檢測外周T細胞淋巴瘤石蠟包埋組織中HTLV-1感染情況以了解外周T細胞淋巴瘤(PTCL)各類型與人類T細胞淋巴瘤病毒Ⅰ型(HTLV-1)的關系。方法根據2008年WHO分類法對46例外周T細胞淋巴瘤進行分類，提取外周T細胞淋巴瘤石蠟組織中人基因組DNA，用PCR方法檢測HTLV-1前病毒。結果收集到的46例外周T細胞淋巴瘤石蠟組織中HTLV-1陽性8例，其中HTLV-1在外周T細胞淋巴瘤，非特殊型(PTCL-U)、NK/T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)、成人T細胞淋巴瘤中(ATLL)中HTLV-1的檢出率分別為15%、8%、10%、75%。結論外周T細胞淋巴瘤存在HTLV-1感染，HTLV-1除與ATLL有密切關系外，與其他類型外周T細胞淋巴瘤也有一定關系。

外周T細胞淋巴瘤；HTLV-1；石蠟包埋組織

外周T細胞淋巴瘤(Peripheral T cell lymphoma，PTCL)是起源于成熟細胞或稱胸腺后細胞的惡性腫瘤。廣義上的PTCL包括除T細胞淋巴母細胞淋巴瘤/白血病以外的所有T/NK細胞淋巴瘤。外周T細胞淋巴瘤是一組具有很強異質性的疾病的總和，其病因尚不清楚，研究發現與免疫缺陷、病毒感染、基因突變等有關。近年來人類T細胞淋巴瘤病毒1(Human T cell lymphotropic virus type 1，HTLV-1)與外周T細胞淋巴瘤的發生發展的關系備受關注，國內外學者幾乎都以患者血液樣本作為實驗材料，罕見應用石蠟包埋瘤組織進行研究，為進一步探討外周T細胞淋巴瘤與HTLV-1之間的關系，我們將收集到的經石蠟包埋的46例外周T細胞淋巴瘤依據2008年WHO分類標準[1]進行分類，并運用PCR方法檢測。

1 材料與方法

1.1 材料來源 收集?？谑腥嗣襻t院、海南醫學院附屬醫院及農墾三亞醫院病理科自1995-2010年診斷為外周T細胞淋巴瘤的石蠟組織，經高年資醫師閱片并結合免疫組織化學結果最終篩選出外周T細胞淋巴瘤46例，并依據2008年WHO最新分類對所篩選出的外周T細胞淋巴瘤進行分類，HTLV-1陽性的人基因組DNA(廈門大學熊君輝博士提供)作為陽性對照，淋巴結反應性增生石蠟組織作為陰性對照，PCR試劑盒(天根生化科技有限公司)，PCR引物合成按參考文獻[2]擴增產物為326 bp(見表1)由生工生物(上海)有限公司合成。

表1 兩對特異性引物

1.2 方法

1.2.1HTLV-1 DNA抽提 石蠟組織DNA抽提參照文獻[3]，每例標本在HE切片對照下，選取病變區域，以消毒刀片挑取約6 mm×3 mm×0.5 mm大小的石蠟組織塊一片，小心置于0.2 ml PCR管中，并加入1×PCR緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L KCl，pH 9.0)50 μl，以加樣槍頭碎裂組織片。100℃加熱15 min，13 200 r/min離心5 min，吸取蠟層與組織片之間的澄清液作為DNA粗提產物作模板。

1.2.2HTLV-1前病毒DNA的PCR法檢測 DNA粗提產物8 μl、10×Taq buffer 5 μl、dNTP混合物(2.5 mmol)4 μl、兩種引物各10 μmol/ml、Taq酶(2.5 U/μl)0.5 μl，加水補至50 μl，混勻，石蠟油覆蓋。反應條件為：94℃預變性10 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，35個循環；72℃后延伸7 min。

1.2.3 PCR產物純化、克隆及測序 取10 μl擴增產物加6×2 μl上樣緩沖液于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳(120 V，30 min)，對照標志物無誤后，切下特異性條帶，用膠回收試劑盒(天根)回收純化擴增產物，克隆入PGM-T載體(天根)，轉化大腸桿菌Top菌株。并由本實驗室進行雙向序列測定。

2 結 果

依據2008年WHO分類，我們所收集到得46例T細胞淋巴瘤具體分類見表2，PCR檢測46例外周T細胞淋巴瘤中HTLV-1陽性8例(占17.39%)，不同類型的外周T細胞淋巴瘤中HTLV-1的檢出率不同，在外周T細胞淋巴瘤非特殊型(PTCL-U)、NK/T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)、成人T細胞淋巴瘤中(ATLL)中HTLV-1的檢出率分別為15%、、10%、75%。

表2 外周T細胞淋巴瘤中HTLV-1的檢測(n=46)

用部分PCR產物1.2%瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1，在326 bp處有一條清晰的條帶，與陽性對照一致?；厥誔CR產物，克隆入T載體并測序后證實是HTLV-1前病毒DNA的pX區的部分序列。

圖1 T細胞淋巴瘤石蠟組織中HTLV-1前病毒PCR檢測的部分結果

3 討論

HTLV-1是人類發現的第一個逆轉錄病毒，在逆轉錄酶的作用下將病毒RNA逆轉錄為cDNA并整合到人類基因組DNA上，位于pX區的TAX基因在該病毒的致病過程中發揮重要作用，主要導致人類T細胞淋巴瘤(ATLL)，因此本實驗根據參考文獻[2]合成了針對TAX部分基因片段的兩對引物。該病毒具有傳染性并呈地域流行，主要流行于日本西南部，在我國的福建和廣東的沿海地區有局部小流行[4]，海南地理及氣候環境與廣東相似，因而海南是否也存在HTLV-1流行引起關注。

本研究通過收集海南省三家醫院病理科診斷為外周T細胞淋巴瘤的石蠟組織并依據2008年WHO分類，收集到的46例外周T細胞淋巴瘤中PTCL-U 20例、NK/T細胞淋巴瘤11例、CTCL 11例、ATLL 4例。運用PCR方法檢測到外周T細胞淋巴瘤中HTLV-1前病毒陽性8例(占17.39%)與唐秋萍等[5]對海南省無償獻血人群HTLV-I/II血清抗體陽性率(0%)的調查相比，說明海南省外周T細胞淋巴瘤的發生與HTLV-1存在密切關系。本實驗中ATLL患者的HTLV-1檢出率高達75%，進一步證實了HTLV-1與ATLL的發病密切相關。CTCL中HTLV-1感染的發生率各家報道不一，從0～100%都有[6-9]，其相關性存在爭議，本實驗中CTCL患者的HTLV-1檢出率為10%，與高紅陽等[10]報道的CTCL中HTLV-1的檢出率(10.5%)相近，說明HTLV-1感染與CTCL的發病可能存在一定關系。T/NK及PTCL-U與HTLV-1的關系國內還未見報道，不過日本曾有研究發現28例PTCL-U中HTLV-1陽性的6例[2]。

總之，以上研究結果表明HTLV-1除與ATLL發病密切相關外，與其他類型的T細胞淋巴瘤也存在一定關系，本實驗成功提取外周T細胞淋巴瘤石蠟包埋組織中HTLV-I的cDNA，以后我們可以充分利用病理科石蠟組織的資源搜集更多的病例，進一步研究外周T細胞淋巴瘤各類型與HTLV-I的關系，同時，我們打算建立HTLV-1感染的動物模型，對其具體的致病機制做進一步研究。

(廈門大學熊君輝博士對本實驗給予了無私的幫助，特此致謝！)

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[3]江 煒,劉衛平,李 雷,等.石蠟包埋組織快速DNA提取方法在診斷病理PCR分析中的應用研究[J].四川大學學報(醫學版), 2007,38(4):709-712.

[4]宋 蓓,戴啟宇,王 輝.人類T淋巴細胞病毒及其相關疾病的研究進展[J].實用醫藥雜志,2009,26(8):73-75.

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[10]高紅陽,單易非,王 平,等.皮膚T細胞淋巴瘤患者的人類T淋巴細胞白血病病毒I型感染[J].復旦學報(醫學版),2002,29(1): 36-38.

Primary study of HTLV-1 infection in paraffin-embeded PTCL tissues.

FAN Lin-lin1,TAN Shun1*,RAO Xiang1, ZHANG Ying-ai2,WANG Shi-hua3.
Department of Pathology1,Central Laboratory2,the Affiliated Haikou Hospital of Xiangya School of Medicine,Central South University,Haikou 570208,Hainan,CHINA;3.Department of Pathology, Hospital of Agricultural Reclamation of Sanya City,Sanya 572000,Hainan,CHINA

Objective To study the relationship between Human T cell leukemia virus type-1(HTLV-1) and peripheral T cell lymphoma(PTCL)by detecting the HTLV-1 infection in paraffin-embeded PTCL tissues.MethodsForty-six samples of PTCL were classified according to World Health Organization classification(2008). Genomic DNA extracted from PTCL was detected by PCR for previous DNA of HTLV-1.ResultsEight of the 46 samples showed positive results in the detection of HTLV-1.The detection rate of HTLV-1 was 3/20,1/12,1/10,and 3/4 for peripheral T cell lymphoma-unspecified(PTCL-U),NK/T cell lymphoma,cutaneous T-cell lymphoma(CTCL),and adult T-cell lymphoma(ATLL),respectively.ConclusionHTLV-1 infection is found in patients with PTCL.HTLV-1 may be related to other type of peripheral T cell lymphoma besidesATLL.

Peripheral T cell lymphoma;HTLV-1;Paraffin-embeded tissues

R37

A

1003—6350(2012)13—001—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.13.001

2012-02-13)

海南省自然科學基金（編號：808240）

凡琳琳（1986-），女山東省菏澤市人，醫師，碩士。

談 順。E-mail:tsc116@163.com