甘藍型油菜自交系的SSR遺傳多樣性分析

王同華，陳衛江，李 莓，王建喜，范連益，曲 亮，惠榮奎

（湖南省作物研究所，湖南 長沙 410125）

利用雜種優勢是提高油菜生產水平的重要手段。育種實踐表明正確評價自交系間的親緣關系、遺傳差異及性狀互補等方面，對于雜種優勢有效利用具有重要意義。但隨著育種材料的頻繁交流、育種方法的不斷創新，導致材料間的系譜關系相互交錯程度大幅度提高，傳統的系譜分析法越來越難以滿足育種材料遺傳多樣性評價的需要。

分子標記的出現為作物育種資源的遺傳多樣性分析提供了新的技術手段，特別是SSR標記具有數量豐富、重復性高、多態性高、共顯性遺傳等優點，已被廣泛應用于作物的品種純度和真實性鑒定、指紋圖譜的繪制及遺傳多樣性分析等研究[1-5]。SSR標記分析具有較高的穩定性和可信度，是作物遺傳多樣性分析的首選分子標記之一[6]。筆者以湖南省作物研究所選育的16份甘藍型油菜自交系為材料，通過SSR標記分析評價其遺傳多樣性，以期為油菜種質資源的有效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料16份，均由湖南省作物研究所選育。其中pol-CMS不育系3份，pol-CMS恢復系11份，溫敏核不育系2份（表1）。

1.2 方法

1.2.1 播種與取樣 2011年9月底將16份供試材料播種于湖南省作物研究所試驗田（上季作物為水稻），于苗期（7葉期左右）每份材料摘取5個單株的幼嫩葉片置于2 mL離心管中，-20℃保存。

1.2.2 SSR分析 基因組DNA提取參照Murry等[7]的方法進行，并略有改進。34對SSR引物序列均來自于http：//ukcrop.net（表2），由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應體系與循環參數參照陸光遠等[8]報道的方法進行，擴增產物在4%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，并在凝膠成像系統中進行觀察、拍照。

表1 16份供試油菜材料的名稱及來源

1.2.3 數據統計分析 根據SSR電泳圖譜顯示的結果，按照各引物在相同電泳遷移率位置上PCR擴增產物帶的有無進行數據統計,其中有帶記為1，無帶記為0，組成1和0的原始矩陣。采用生物學軟件NTSYS-pc2.10e進行數據分析，先利用SimQual程序計算材料間的遺傳相似系數（Genetic Similarity,GS），獲得相似系數矩陣，再用SHAN程序中的UPHMA進行聚類分析，并通過Treeplot模塊生成聚類樹狀圖,并以簡單配對參數計算基因頻率。按照Nei提出的公式計算SSR位點的多態性信息含量（Polymorphism information content,PIC），PIC=1-∑fi2，其中 fi為 i位點的基因頻率[9]。

2 結果與分析

2.1 SSR標記的多態性表現

34對SSR引物在16份供試油菜材料中共產生72條清晰的擴增條帶，平均每對引物產生2.12條。擴增條帶長度在100～650 bp之間，以150～350 bp的片段為主。圖1為引物CB10364和MR049對供試材料的SSR擴增結果，其他引物的擴增效果基本與該引物的擴增效果相當。在34對SSR引物中，28對引物的PCR擴增條帶在供試材料中表現出明顯多態性，多態性比例為82.4%。多態性位點的PIC值在0.12～0.73之間，平均為0.39，其中以引物CB10427的最高（0.73），引物BnGMS633、BnGMS687、Na12-A02、Na12-E09、Na10-D11、Na10-D08的最低，平均為0.12。由此可見，研究選用的SSR引物具有較好的穩定性和多態性，也表明供試材料在這些位點存在較高的遺傳變異。

表2 SSR引物序列信息

圖1 引物CB10364和引物MR049對16份供試材料的SSR-PCR擴增

2.2 聚類分析

利用生物學軟件NTSYS-pc2.10e對16份供試油菜材料進行聚類分析，結果表明供試的16份材料可以被完全區分開，各材料間的遺傳相似系數在0.52～0.90之間，平均為0.63。其中，10個pol-CMS恢復系間的遺傳相似系數在0.52～0.90之間，平均為0.61；3個pol-CMS不育系間遺傳相似系數在0.71～0.86之間，平均為0.79；2個溫敏核不育系間的遺傳相似系數為0.90。如圖2所示，在遺傳相似系數為0.685時，供試材料可分為A、B、C 3個類群。A類群包含7份材料（5份pol-CMS恢復系、2份溫敏核不育系）；B類群包含8份材料（4個pol-CMS不育系、4個pol-CMS恢復系）；C類群僅包含1份pol-CMS恢復材料。研究結果表明，在16份供試材料中，pol-CMS恢復系材料間存在較好的遺傳多樣性，pol-CMS不育系材料間的遺傳多樣性相對較差，2份溫敏核不育系材料的遺傳背景非常相近。

3 討論

研究利用選取的34對SSR引物對16份供試油菜育種材料進行了遺傳分析，結果表明在供試材料中，pol-CMS恢復系材料間具有較好的遺傳多樣性，而pol-CMS不育系材料與溫敏核不育系材料的遺傳多樣性較狹窄。該結果可能與以上育種材料的選育方法密切相關，研究中pol-CMS恢復系大多通過同質恢復系進行選育，即通過已有雜交組合直接自交純合，或利用已有的pol-CMS恢復系材料直接回交轉育，其恢復系材料的遺傳基礎易于拓展，遺傳背景相對廣泛。而pol-CMS不育系的選育主要源于對已有不育系的回交改良，該類型不育系存在不同程度的低溫敏感現象，因此pol-CMS不育系的選育對核心親本的依賴性較強，往往幾個不育系均含一個核心不育系的血緣。另外，研究中溫敏核不育系材料由于受多對隱性基因控制，新型系轉育更為困難，研究供試的2個溫敏核不育系均來源于隱性核不育系86A后代分離群體，有著明顯的遺傳相似性。

對16份供試材料的聚類結果表明，來源于中國農業科學院油料研究所中油雜系列的Z2R、Z8R優先聚到一起，來源于隱性核不育系86A的91S、402S優先聚到一起，含有SC4的血緣的169A與SC4優先聚到一起，通過品質改良17A選育的不育系167A與17A也優先聚到一起。這充分說明SSR揭示的遺傳多樣性與地理來源和系譜來源基本一致，可以充分反映材料間的遺傳差異。在該研究中恢復系95-5單獨聚為一類，與其他材料間具有明顯的遺傳特異性，而在表型上該恢復系確實具有土黃色花瓣、種皮自然開裂等非常特殊的農藝性狀，需注意對該特異種質資源的保存和利用。由此可見，SSR聚類結果較好地反映了材料間的親緣關系，可為育種資源的有效利用提供參考。

[1]梅德圣，李云昌，胡 瓊，等.甘藍型油菜中油雜8號種子純度的 SSR 鑒定[J].中國農學通報，2006，22（5）：49-52.

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[4]胡景濤，黃文章，嚴明建，等.重慶市雜交水稻主要親本的SSR遺傳多態性分析[J].湖南農業科學，2011，（4）：1-6.

[5]許 鯤，張冬曉，伍曉明，等.國家冬油菜區試新品種SSR指紋圖譜構建與遺傳關系分析 [J].中國油料作物學報，2008，30（1）：29-34.

[6]朱 英，陶 剛，祝云芳，等.利用SSR標記分析12份優良玉米自交系的遺傳多樣性[J].貴州農業科學，2011,39(8)：18-20.

[7]Murry H G,Thomspon W F.Rapid isolation of weight DNA[J].Nucleic Acides Res,1980,8：4321-4325.

[8]陸光遠，楊光圣，傅廷棟.一個簡便的適合于分析油菜中SSR位點的檢測體系[J].中國油料作物學報，2003，25（3）：79-81.

[9]Nei M.Analysis of gene diversity in subdivided populations[J].Proc.Natl.Acad.Sci.,1973,70：3321-3323.