E2弱化雙酚A雌激素活性機制

張光明，郎 朗，李 鈺，馬 軍

(1.哈爾濱工業(yè)大學 市政環(huán)境工程學院，150090哈爾濱;2.中國人民大學 環(huán)境學院，100872北京;3.哈爾濱商業(yè)大學生命與環(huán)境科學研究中心，150028哈爾濱;4.哈爾濱工業(yè)大學理學院，150001哈爾濱)

內(nèi)分泌干擾物(EDCs)可致人體內(nèi)分泌失調(diào)，引發(fā)多種疾病，還會對后代帶來不良影響.雙酚A是典型的雌激素類EDCs，可嚴重干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)，威脅著胎兒和兒童的健康.歐盟認為雙酚A會誘發(fā)性早熟，從2011年3月2日起，禁止生產(chǎn)含雙酚A的嬰兒奶瓶.在我國北京、上海、深圳、杭州等大中城市飲用水水源中均發(fā)現(xiàn)了一定濃度的雙酚A［1］，其雌激素活性的有效控制引起廣泛關注.雌二醇(E2)是人體天然雌激素的代表物質(zhì).前期研究發(fā)現(xiàn)E2與雙酚A共存時可以弱化雙酚A的雌激素活性［2］.這一現(xiàn)象對于控制雙酚A對人體尤其是女性的毒害作用具有重要意義.本文將深入研究這一現(xiàn)象發(fā)生的可能機制.

1 實驗

所用乳腺癌MCF-7細胞為實驗室自行培養(yǎng).雙酚A、E2、苯甲基磺酰氟(PMSF)、抑肽酶A、亮抑肽酶、色胺酸等購自美國Sigma公司.丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)購自美國Ameresco公司.其他材料為國產(chǎn)分析純試劑.實驗中雙酚A、E2濃度分別為10-8、10-12mol/L.所用主要設備包括GeneAmp?PCR System 9700(Applied Biosystems公司)、DYY-6B電泳儀(北京市六一儀器廠)、蛋白質(zhì)電泳及Western雜交轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad)、LSM Meta510激光共聚焦儀(Zeiss公司)、IGO 150二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司).

采用流式細胞儀法測定細胞周期的變化［3］.細胞增殖指數(shù)ⅠP=(nS+nG2)/(nG1+nS+nG2)×100%，nS為DNA合成期細胞數(shù);nG1為第1間隙期細胞數(shù);nG2為第2間隙期細胞數(shù).

采用WESTERN BLOT法測定乳腺癌MCF-7細胞內(nèi)雌激素受體α蛋白，以及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導通路相關蛋白.該方法可檢測到低至10～100 pg的環(huán)境雌激素的干擾效應［4］.蛋白樣品制備、SDS-PAGE電泳、Lowry法測定蛋白含量、免疫反應、化學發(fā)光、顯影、定影等均參照分子生物學蛋白檢測方法［5］.以β-Tublin蛋白作為內(nèi)參照，對目的蛋白表達量進行校正.

采用RT-PCR法測定EDCs干擾效應相關的轉(zhuǎn)錄因子C-fos、C-jun.步驟如下:細胞培養(yǎng)、RNA抽提、分離、沉淀、洗脫、再溶解、定量、逆轉(zhuǎn)錄(RT)、聚合酶鏈式反應、電泳鑒定［5］.

2 結(jié)果與討論

2.1 對細胞周期的影響

細胞分裂復制的過程稱為細胞周期.整個細胞周期被劃分為G1→S→G2→M→G1，其中最具特征性的階段是S期(DNA合成期)，經(jīng)過短暫間隙(G2)，進入有絲分裂期(M期)，再經(jīng)過短暫間隙(G1)，開始下一個周期.一旦調(diào)控系統(tǒng)發(fā)生故障，細胞就會過度增殖導致癌癥［6］.

從表1可以看出，E2、雙酚A及混合物均可改變MCF-7細胞周期，提高增殖指數(shù)ⅠP.E2使S期細胞比例由25.1%增加到34.2%，提高了9.1%，由于細胞在S期發(fā)生DNA合成，S期比例提高說明DNA合成增加.雙酚A也可提高S期細胞比例，但效果較E2弱.而二者混合后，S期細胞提高比例進一步降低.此外，雙酚A還可誘導G2期細胞比例增加5.4%，而E2則降低了G2期細胞比例1.3%.上述差異表明，E2與雙酚A對MCF-7細胞的增殖機制不同.

表1 E2與雙酚A聯(lián)合作用于MCF-7細胞的周期變化%

2.2 蛋白表達

蛋白表達如圖1所示.顯然，空白組ERα蛋白表達良好，ERK系列蛋白表達較低，JNK系列蛋白與p38表達極弱，C-myc幾乎不表達.各實驗組的蛋白表達詳細分析見下文.

圖1 E2與雙酚A聯(lián)合對MCF-7細胞內(nèi)蛋白表達的影響

2.3 雌激素受體蛋白表達

EDCs干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的傳統(tǒng)途徑是與雌激素受體(ER)結(jié)合，從而使天然雌激素不能有效結(jié)合ER.在MCF-7細胞中最重要的ER是ERα蛋白［7］，因此，EDCs發(fā)揮雌激素活性主要是與ERα蛋白結(jié)合，使其不能正常表達，這是雌激素作用的經(jīng)典路徑［8］.圖2所示為E2、雙酚A、混合物對ERα蛋白的影響，E2對ERα蛋白的誘導能力最強、雙酚A最弱、混合物介于二者之間.圖2表明，E2、雙酚A、混合物均可通過經(jīng)典路徑——雌激素受體途徑發(fā)揮作用.

2.4MAPK信號轉(zhuǎn)導通路研究

除了經(jīng)典途徑外，EDCs起作用的另一個重要途徑是干擾MAPK信號轉(zhuǎn)導通路.MAPKs(絲裂原活化蛋白激酶)是重要的信號傳遞者［9］，其種類眾多，最重要的有胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、c-jun氨基末端激酶(JNK)、p38等［10］.ERK1/2信號通路是經(jīng)典的MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑.活化的ERK1/2可磷酸化多種核轉(zhuǎn)錄因子，并誘導C-fos基因活化，增加C-fos蛋白合成［11］.

圖2 E2與雙酚A聯(lián)合對MCF-7細胞ERα蛋白的影響

圖3所示為E2、雙酚A、混合物對MCF-7細胞內(nèi)ERK蛋白表達的影響.E2顯著提高了ERK蛋白的表達，雙酚A基本沒有影響，混合物效果略低于E2.圖4所示為三者對活化后的ERK——p-ERK蛋白的影響.溶劑對照組p-ERK蛋白不表達，E2顯著提高了p-ERK蛋白的表達量，而雙酚A基本沒有作用，混合物效果與E2相當［12］.圖3、4均表明，雙酚A對ERK信號通路沒有作用.

圖3 E2與雙酚A聯(lián)合對MCF-7細胞ERK蛋白的影響

圖4 E2與雙酚A聯(lián)合對MCF-7細胞p-ERK蛋白的影響

圖5所示為E2、雙酚A、混合物對另一個重要MAPKs——JNK信號通路的影響.溶劑對照組JNK蛋白基本不表達，E2對其有一定增強作用，雙酚A使其大量表達，而混合物對JNK蛋白表達的促進明顯高于E2或雙酚A.但由圖1可以看出，JNK蛋白的活化形式——p-JNK蛋白在各種條件下表達量都較低，表明E2及BPA雖然刺激了JNK蛋白表達，但最終不能提高其活性，JNK通路并非其作用途徑.

p38絲裂原活化蛋白激酶是MAPKs家族中的一員，調(diào)控應激情況下的細胞增殖和凋亡［13］.如圖6所示，E2能夠誘導p38蛋白的表達，而BPA使p38蛋白的表達量下降，兩者混合后對p38的誘導介于兩者之間.由于p-p38蛋白不表達，判斷p38在E2、BPA及聯(lián)合誘導增殖中不發(fā)揮作用.C-myc通過對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)發(fā)揮其生物學效應［14］.如圖7所示，溶劑組C-myc蛋白不表達，E2顯著誘導其表達，雙酚A對其沒有影響，而混合物的誘導效應遠遠低于E2(0.092vs.0.017).如此顯著的降低表明，E2與雙酚A混合后，雌激素效應降低的主要機制是C-myc蛋白表達受到了抑制.

圖5 E2與雙酚A聯(lián)合對MCF-7細胞JNK蛋白的影響

圖6 E2與雙酚A聯(lián)合對MCF-7細胞p38蛋白的影響

圖7 E2與雙酚A聯(lián)合對MCF-7細胞C-myc蛋白的影響

如圖8所示，E2能夠誘導C-fos基因的表達，雙酚A對C-fos基因基本沒有影響，兩者聯(lián)合后作用介于兩者之間.如圖9所示，E2、雙酚A、混合物均可減弱C-jun基因的表達，混合物效應略強，但差別不大.

圖8 E2與雙酚A聯(lián)合對MCF-7細胞C-fos基因的誘導

圖9 E2與雙酚A聯(lián)合對MCF-7細胞C-jun基因的影響

如圖10、11所示，E2、雙酚A、混合物均可誘導Ki67蛋白的表達且混合物表現(xiàn)出增強效應.E2顯著誘導cyclin D1蛋白表達，雙酚A較E2弱很多，聯(lián)合后E2使雙酚A對cyclin D1蛋白的誘導增強.

圖10 E2與雙酚A聯(lián)合對Ki67蛋白的影響

圖11 E2與雙酚A聯(lián)合對cyclin D1蛋白的影響

3 結(jié)論

1)E2、雙酚A、混合物都具有雌激素效應，可以促進MCF-7細胞的增殖.E2既可以通過經(jīng)典途徑(雌激素受體)起作用，又可以通過非經(jīng)典途徑(ERK信號通路)起作用.

2)E2可以促進C-myc基因與C-fos基因表達、誘導增殖蛋白Ki67與cyclin D1蛋白表達，增加DNA分裂期細胞比例，促進細胞增殖.而雙酚A只通過雌激素受體途徑起作用，激活cyclin D1蛋白.兩者混合后，可通過受體途徑及ERK途徑發(fā)揮作用，促進C-fos基因的轉(zhuǎn)錄表達，促進Ki67蛋白表達.然而，C-myc蛋白顯著下降，這可能是E2弱化雙酚A雌激素效應的主要機制.

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