HPLC法同時測定婦可靖膠囊中木犀草素和芍藥苷的含量

袁春玲，王佩琪，郭偉英（遼寧醫學院，遼寧錦州 121001）

婦可靖膠囊由北敗醬、赤芍等中藥組成，具有清熱利濕、化瘀散結、行氣止痛的功效，用于治療慢性盆腔炎，證見帶下量多、小腹墜痛、腰骶酸痛等。據文獻報道，北敗醬中主要含有木犀草素[1]，該成分有抗氧化、抑菌、抗炎、抗腫瘤等活性[2]；赤芍清熱涼血、散瘀止痛，其主要有效成分為赤芍總苷，其中芍藥苷、芍藥內酯苷含量較高[3]。為了更好地控制產品質量，保證其療效，本試驗首次采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定婦可靖膠囊中木犀草素和芍藥苷的含量。

1 儀器與試藥

FL2000型HPLC儀，含FL2000紫外檢測器、FL9500S色譜工作站（浙江溫嶺福立分析儀器有限公司）；KQ-100A型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TD型電子天平（德國賽多利斯公司）。

木犀草素、芍藥苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111520-200809、110736-200805）；婦可靖膠囊（甘肅醫藥集團西峰制藥廠，批號：080936、081104、090223）；甲醇（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；無水乙醇、磷酸為分析純，水為重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Chromatrex C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸（35∶65）；檢測波長：230 nm（檢測芍藥苷）、350 nm（檢測木犀草素）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：室溫；進樣量：20.0 μL。理論板數按木犀草素峰計算應不低于4 000；分離度均＞1.5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取經60℃減壓干燥8 h的木犀草素、芍藥苷對照品適量，置同一25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋制成濃度分別為65、50 μg·mL-1的混合對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品研細，精密稱取0.5 g，加甲醇50 mL，超聲提取（功率：100 W，頻率：40 kHz）20 min，濾過，殘渣用15 mL甲醇分3次洗滌，洗液合并濾液至100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，再經0.45 μm濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按婦可靖膠囊的組成處方及生產工藝分別制成不含北敗醬和不含赤芍的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法分別制得缺北敗醬和缺赤芍的陰性對照溶液。

2.3 干擾試驗

照上述色譜條件，分別取混合對照品溶液、供試品溶液、2種陰性對照溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，可得供試品中其他成分對木犀草素、芍藥苷的測定無干擾。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；C.缺北敗醬的陰性對照；D.缺赤芍的陰性對照；1.木犀草素；2.芍藥苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.test sample；C.negative control without Herba Patrinia；D.negative control without Radix Paeoniae Rubra；1.luteolin；2.paeoniflorin

2.4 線性關系考察

精密吸取混合對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL，按上述色譜條件分別進樣，測定峰面積。以進樣量（X）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得木犀草素的回歸方程為Y＝52 979X－1 883（r＝0.999 9，n＝5），進樣量線性范圍為0.065～0.325 μg；芍藥苷的回歸方程為Y＝48 638X－79.69（r＝0.999 8，n＝5），進樣量線性范圍為0.05～0.25 μg。

2.5 精密度試驗

在上述色譜條件下，精密吸取混合對照品溶液20.0 μL，連續進樣5次，測定峰面積。結果，木犀草素、芍藥苷峰面積的RSD分別為0.81%、0.29%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一批樣品適量，共6份，分別按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，在上述色譜條件下測定。結果，木犀草素、芍藥苷的平均含量分別為6.36、1.76 μg·g-1，RSD分別為0.37%、1.16%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗

取同一批供試品溶液適量，按上述色譜條件每隔1 h進樣1次，連續測定6次。結果，木犀草素、芍藥苷峰面積的RSD分別為0.17%、0.68%（n＝6），表明供試品溶液在6 h內穩定。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號：090223）9份，每份約5.0 g，分別按相當于樣品中木犀草素、芍藥苷含量的80%、100%、120%的量加入各對照品（不同加入量各3份），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 木犀草素和芍藥苷的加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test of luteolin and paeoniflorin（n＝9）

2.9 樣品含量測定

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

本試驗采用超聲技術提取木犀草素和芍藥苷，筆者分別對提取溶劑（100%甲醇、95%乙醇、水）、提取時間（10、20、30 min）進行了考察。結果表明，以100%甲醇為溶劑的提取效率明顯高于其他溶劑，超聲20 min即可將測定成分提取完全，故本試驗中供試品溶液的制備均用甲醇超聲提取20 min。

為同時測定婦可靖膠囊中木犀草素和芍藥苷的含量，筆者參考相關文獻[4]并經多次試驗，最終擬定以甲醇-0.4%磷酸（35∶65）為流動相。由于木犀草素和芍藥苷的最大吸收波長相差較大，為保證兩者含量測定的靈敏度，故對先流出色譜柱的木犀草素采用350 nm檢測波長，15 min始檢測波長置230 nm檢測芍藥苷。

綜上，本方法簡便、準確，可用于婦可靖膠囊的質量控制。

[1]楊 亮，張亞鋒，王新立，等.HPLC法測定北敗醬中木犀草素的含量[J].陜西中醫，2008，29（3）：354.

[2]楊 穎，宋曙輝，徐桂花.黃酮類化合物木犀草素研究進展[J].糧食與油脂，2009，9：45.

[3]姜曉燕，羅 琳，竇志華，等.HPLC法測定赤芍飲片中芍藥內酯苷及芍藥苷的含量[J].齊魯藥事，2008，27（3）：147.

[4]陳華國，靳鳳云，趙 超，等.HPLC法測定對坐葉中木犀草素的含量[J].中國藥房，2009，20（36）：2 838.