石榴皮鞣質對大鼠乙醇性胃黏膜損傷的保護作用研究

邱紅梅，賴舒，尚京川，周岐新#（.重慶醫(yī)科大學藥學院藥理教研室/重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 40006；重慶醫(yī)科大學藥物分析教研室，重慶 40006）

石榴皮是石榴科植物石榴（Punica granatunL）的干燥果皮，其主要成分為石榴皮鞣質，占10.4%～21.3%。石榴皮性溫，味澀，入肺、腎、結腸經(jīng)，具有生津止渴、澀腸、止血等功效[1，2]。有研究證明，石榴皮的提取物對多種原因引起的消化系統(tǒng)潰瘍有保護作用。石榴皮提取物可抑制大鼠幽門結扎型胃潰瘍的形成[3]；也對大鼠阿司匹林和乙醇誘導的實驗性胃黏膜損傷和結腸炎有保護作用[4]，但其作用機制尚未見報道。為此，本研究采用丙酮提取和乙酸乙酯萃取法獲得石榴皮鞣質，觀察其對大鼠乙醇性胃黏膜損傷的保護作用并對其作用機制進行研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SZ297型自動三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；保溫干燥箱（重慶實驗設備廠）；A2000S型電子分析天平（德國Sartorius公司）；721型分光光度計（上海第三分析儀器廠）；SN-695型智能γ-計數(shù)器（上海核福光電儀器有限公司）；－70℃低溫冰箱（德國Forma Scientic公司）；3K30型低溫離心機（德國Sigma公司）；UV265紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；BH-2型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；CM-2000B型生物醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)（北京航天航空大學）。

1.2 試藥

干燥石榴皮（批號：070911），購自徐州醫(yī)藥有限公司中藥飲片廠，由重慶醫(yī)科大學化學教研室尚京川教授參照丙酮提取、醋酸乙酯萃取法從石榴皮中提取鞣質，總鞣質含量為73%[5]；枸櫞酸鉍鉀（麗珠集團麗珠制藥廠，批號：070906）；一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）測試盒（南京建成生物工程研究所）；多聚賴氨酸、兔抗一氧化氮合酶（NOS）1多克隆抗體、兔抗NOS2多克隆抗體、兔抗NOS3多克隆抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程公司）。

1.3 動物

清潔級SD大鼠，♀♂兼半，體重180～230g，由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供（動物使用合格證號：SCXK（渝）20020001）。

2 方法

2.1 復制模型和分組、給藥

實驗分為6組，即正常（等容生理鹽水）、模型（等容生理鹽水）、枸櫞酸鉍鉀（100mg·kg－1）和石榴皮鞣質高、中、低劑量（500、150、50mg·kg－1）組。ig給藥，給藥體積為0.01mL·g－1，給藥2h后除正常組外其余各組均ig無水乙醇1.5mL/只以復制幽門結扎型胃潰瘍大鼠模型。

2.2 觀察指標

2.2.1 胃黏膜潰瘍指數(shù)的觀察 ig無水乙醇1h后，處死大鼠，打開腹腔并結扎賁門和幽門，向胃腔內注入1%甲醛溶液2mL后，取出胃并立即浸泡于1%甲醛中5min，然后用清水漂洗胃體，10min后按照Main and Whittle方法[4]直接測量胃部潰瘍面積，觀察并記錄潰瘍得分數(shù)：潰瘍長度為≤1、1～2、2～3mm時分數(shù)分別為1、2、3。將記錄總分除以10得潰瘍指數(shù)，并按下列公式計算潰瘍抑制率：潰瘍抑制率＝（模型組潰瘍指數(shù)－給藥組潰瘍指數(shù)）/模型組潰瘍指數(shù)×100%。

2.2.2 胃黏膜病理形態(tài)學的觀察 ig無水乙醇1h后，處死大鼠，打開腹腔并結扎賁門和幽門，向胃腔內注入1%甲醛溶液2mL后，取出胃，從胃竇至胃體取下一條狀胃組織，置于10%福爾馬林液中固定6～8h，乙醇梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋切片（切片厚約4μm），HE染色，光鏡下進行組織形態(tài)學觀察。保存切片供免疫組化分析用。

2.2.3 胃黏膜NO和MDA含量的檢測 將“2.2.2”項下取完條狀組織后余下鼠胃，于冰浴上用濾紙吸干，迅速刮取胃黏膜，于－70℃貯藏，備用。稱重，用冰生理鹽水制成10%胃黏膜組織勻漿。4℃下2000r·min－1離心8min，取上清液，按試劑盒說明書進行NO、MDA測定。

2.2.4 胃黏膜神經(jīng)元型（n）NOS、內皮型（e）NOS表達的檢測 取石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水；切片滴加3%H2O2液，室溫孵育10min，滅活內源性過氧化物酶；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min；將切片浸入0.01mol·L－1枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）中，電爐加熱至沸騰后斷電，間隔10min，反復上述操作2次，冷卻；PBS沖洗3min×3次；滴加抗原修復液Ⅰ于切片上，室溫10min后PBS沖洗3min×3次；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min，甩去多余液體，不洗；分別滴加兔抗NOS1多克隆抗體、兔抗NOS2多克隆抗體（稀釋度為1∶100），4℃過夜；PBS沖洗5min×5次；滴加生物素化山羊抗鼠IgG，37℃孵育20min；PBS沖洗5min×3次；滴加試劑SABC，37℃孵育20min；PBS沖洗5min×4次；滴加DAB在室溫下顯色，鏡下控制反應時間，出現(xiàn)棕黃色顆粒時即用蒸餾水沖洗終止反應；50℃條件下脫水，用二甲苯透明，中性樹膠封片；光鏡下觀察nNOS、eNOS蛋白分布；采用生物醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)分析，每張切片取2個視野，在10×20倍視野下測面積陽性積分光密度，并以其代表nNOS、eNOS蛋白含量。

2.3 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 胃黏膜潰瘍指數(shù)與潰瘍抑制率

與模型組比較，石榴皮鞣質高、中劑量組大鼠胃潰瘍指數(shù)顯著降低（P＜0.01），潰瘍抑制率顯著增加（P＜0.01）。石榴皮鞣質對模型大鼠胃黏膜的影響見表1、圖1。

表1 石榴皮鞣質對模型大鼠胃黏膜的影響（±s，n＝8）Tab 1 Effects of tannins from P.granatum on gastric mucosa in model rats（±s，n＝8）

表1 石榴皮鞣質對模型大鼠胃黏膜的影響（±s，n＝8）Tab 1 Effects of tannins from P.granatum on gastric mucosa in model rats（±s，n＝8）

與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.normal group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

潰瘍抑制率/%組別正常組模型組石榴皮鞣質低劑量組石榴皮鞣質中劑量組石榴皮鞣質高劑量組枸櫞酸鉍鉀組潰瘍指數(shù)/級-10.92±1.21＊9.77±2.532.71±1.11#0.24±0.12#0.16±0.07#- 011.075.0#97.8#98.5#

3.2 胃黏膜病理組織切片觀察

HE染色后，光鏡下觀察可見正常組大鼠胃黏膜層厚薄均勻，組織結構層次清楚，上皮完整，連續(xù)性好，腺體排列整齊，無充血現(xiàn)象；模型組大鼠乙醇所致胃黏膜損傷雖未累及黏膜肌層，但可見黏膜灶狀糜爛出血，上皮細胞受損破壞，黏液腺脫落，上皮與固有層分離，腺體結構破壞甚至凝固性壞死，核固縮，固有層毛細血管擴張充血，且見中性粒細胞、少量淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和漿細胞等急、慢性炎癥細胞浸潤；而枸櫞酸鉍鉀和石榴皮鞣質高劑量組大鼠胃黏膜未見明顯損傷，上皮細胞偶有損傷亦較輕微，僅見毛細血管擴張充血、炎性分泌物、少量壞死組織和纖維蛋白。石榴皮鞣質對模型大鼠損傷性胃黏膜病理形態(tài)學影響見圖2。

圖1 石榴皮鞣質對模型大鼠胃黏膜的影響A.模型組；B.石榴皮鞣質低劑量組；C.石榴皮鞣質中劑量組；D.石榴皮鞣質高劑量組；E.枸櫞酸鉍鉀組Fig 1 Effects of tannins from P.granatum on gastric mucosa in model ratsA.model group；B.tannins from P.granatum low-dose group；C.tannins from P.granatum medium-dose group；D.tannins from P.granatum high-dose group；E.colloidal bismuth subcitrate group

3.3 胃黏膜MDA、NO含量檢測

與正常組比較，模型組MDA含量顯著升高，NO含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，石榴皮鞣質高、中劑量組MDA含量顯著降低，NO含量顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）。石榴皮鞣質對模型大鼠胃黏膜NO和MDA含量的影響見表2。

3.4 胃黏膜nNOS、eNOS表達水平分析

免疫組化分析顯示，正常組nNOS、eNOS在胃組織廣泛分布。與正常組比較，模型組nNOS、eNOS在胃組織的分布與正常大鼠一致，但表達量均顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。與模型組比較，石榴皮鞣質高、中、低劑量組nNOS、eNOS在胃黏膜的表達有減弱趨勢，但無顯著性差異。石榴皮鞣質對模型大鼠胃黏膜nNOS、eNOS表達的影響見表3。

圖2 石榴皮鞣質對模型大鼠損傷性胃黏膜病理形態(tài)學影響（HE染色，200×）A：正常組；B：模型組；C：石榴皮鞣質高劑量組；D：枸櫞酸鉍鉀組Fig 2Effect of pathomorphology of tannins from P.granatum on gastric mucosa in model rats（HE staining，200×）A.normal group；B.model group；C.tannins from P.granatum highdose group；D.colloidal bismuth subcitrate group

表2 石榴皮鞣質對模型大鼠胃黏膜NO和MDA含量的影響（±s，n＝8）Tab 2Effects of tannins from P.granatum on the contents of NO and MDAin gastric mucosa in rats（±s，n＝8）

表2 石榴皮鞣質對模型大鼠胃黏膜NO和MDA含量的影響（±s，n＝8）Tab 2Effects of tannins from P.granatum on the contents of NO and MDAin gastric mucosa in rats（±s，n＝8）

與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

NO 含量/μmo l·g－1 1.42±0.230.57±0.15＊0.62±0.240.80±0.24#1.24±0.42#1.73±0.14##組別正常組模型組石榴皮鞣質低劑量組石榴皮鞣質中劑量組石榴皮鞣質高劑量組枸櫞酸鉍鉀組M D A 含量/n mo l·mg－1 1.25±0.513.65±0.93＊3.11±1.372.26±0.95#1.52±0.56##1.61±0.47##

表3 石榴皮鞣質對模型大鼠胃黏膜nNOS、eNOS表達的影響（±s，n＝8）Tab 3 Effects of tannins from P.granatum on nNOS and eNOS expression in gastric mucosa in rats（±s，n＝8）

表3 石榴皮鞣質對模型大鼠胃黏膜nNOS、eNOS表達的影響（±s，n＝8）Tab 3 Effects of tannins from P.granatum on nNOS and eNOS expression in gastric mucosa in rats（±s，n＝8）

與正常組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.normal group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別正常組模型組石榴皮鞣質低劑量組石榴皮鞣質中劑量組石榴皮鞣質高劑量組n NO S光密度/μm2 0.79±0.110.45±0.09＊＊0.39±0.040.56±0.050.58±0.05e NO S光密度/μm2 0.59±0.080.37±0.04＊0.36±0.050.43±0.070.49±0.03

4 討論

胃潰瘍是一種嚴重危害人類健康的常見病、多發(fā)病，酒精性胃黏膜損傷是常見的發(fā)病原因之一。本研究采用ig無水乙醇復制酒精性胃潰瘍模型。結果表明，預先給予石榴皮鞣質能顯著減輕乙醇引起的胃黏膜損傷，提示石榴皮鞣質是防治酒精性胃黏膜損傷的有效候選藥物。

胃腸黏膜在化學物質、缺血或細胞能量不足等情況下可產(chǎn)生大量的氧自由基，氧自由基在整體水平和細胞水平都可以引起胃黏膜或黏膜細胞的脂質過氧化，導致胃黏膜血流障礙，引發(fā)胃黏膜損傷[6]。本研究表明，乙醇損傷性胃黏膜組織中MDA含量明顯升高，提示脂質過氧化反應參與了大鼠乙醇性胃黏膜損傷的病理、生理過程。預先ig石榴皮鞣質可明顯抑制模型大鼠胃黏膜MDA含量升高，提示其減少自由基生成、降低抗脂質過氧化反應可能與其胃黏膜保護作用密切相關。

NO是胃腸道非膽堿能非腎上腺素能神經(jīng)所釋放的一種神經(jīng)介質和信使分子，由NOS催化生成。正常分泌的NO可能通過增加胃黏膜血流量[7]，維持胃黏膜上皮的完整性，參與黏膜損傷后的保護與修復[7，8]，抑制炎性細胞的趨化和黏附[9～12]等途徑發(fā)揮胃黏膜保護作用。國內、外研究報道，NOS的抑制劑NG-硝基-L-精氨酸可加重酒精所致的胃黏膜損傷，提出胃黏膜NO含量的下降與胃潰瘍的發(fā)生有直接關系[13～16]。本研究表明，乙醇性急性胃黏膜損傷模型大鼠的胃黏膜組織內NO含量明顯降低，預先給予石榴皮鞣質能顯著阻遏NO水平下降，提示胃黏膜組織內NO含量降低可能參與了模型大鼠乙醇性急性胃黏膜損傷的病理過程，而石榴皮鞣質的抗損傷作用與其阻遏NO水平下降有關。

在此基礎上，筆者進一步研究了石榴皮鞣質阻遏NO水平下降的機制。機體內NO含量的高低主要是由NOS調控的。胃黏膜的NOS主要分為兩大類，即依賴Ca2+的固有型NOS（cNOS，包括nNOS和eNOS）和不依賴Ca2+的誘導型NOS（iNOS）。cNOS主要分布于神經(jīng)元和內皮細胞，具有穩(wěn)定的活性，持續(xù)釋放少量NO而發(fā)揮保護胃黏膜的作用。有報道稱，水拘禁應激性胃潰瘍的發(fā)生與胃黏膜nNOS和eNOS的過度抑制密切相關。本研究表明，與正常大鼠胃黏膜比較，乙醇損傷性胃黏膜組織內nNOS和eNOS的分布無明顯差異，但其表達顯著降低，提示胃黏膜nNOS和eNOS的變化參與了乙醇性胃黏膜損傷；預先給予石榴皮鞣質有阻遏nNOS和eNOS的表達下降的趨勢，但未見顯著性差異。

綜上所述，本研究證明石榴皮鞣質具有防治乙醇性胃損傷作用，此作用可能與降低抗脂質過氧化反應、阻遏胃黏膜nNOS和eNOS的表達下降，調控NO含量在正常水平有關。

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