頭孢地尼微生物限度檢查方法的驗證探討

馬繼紅 王洪珊

（哈藥集團有限公司制藥總廠 黑龍江 哈爾濱 150086）

1 驗證材料

1.1 供試品：頭孢地尼（批號：201204012012040220120403）。

1.2 培養(yǎng)基及試液：營養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂、營養(yǎng)肉湯、乳糖膽鹽培養(yǎng)基、改良馬丁、四硫磺酸鈉、膽鹽硫乳瓊脂、曙紅亞甲藍瓊脂、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

1.3 菌種：枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉。

1.4 儀器：電熱恒溫水浴鍋、電動離心機。

1.5 青霉素酶（600萬單位/支）張家口市格瑞生物化學科技有限公司。

2 驗證步驟

2.1 菌液制備

2.1.1 接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，30～35℃培養(yǎng)18～24小時，分別取各菌種培養(yǎng)液1mL加入9mL0.9%無菌氯化鈉中，10倍依次稀釋，金黃色葡萄球菌稀釋至10-5，大腸埃希菌稀釋至10-7，枯草芽孢桿菌稀釋至10-5，約為50～100cfu/mL，備用。

2.1.2 接種白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基，23～28℃培養(yǎng)24～48小時，取培養(yǎng)液1mL加入9mL0.9%無菌氯化鈉中，10倍依次稀釋至 10-6，約為 50～100cfu/mL，備用。

2.1.3 取黑曲霉新鮮培養(yǎng)物用5mL0.9%無菌氯化鈉適量與標準比濁管進行比較，取比濁后的菌懸液1mL加入9mL0.9%無菌氯化鈉中，10倍依次稀釋至10-4，約為50～100cfu/mL，備用。

2.2 供試液制備

取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，水浴（45℃）保溫振搖，分散混勻，制成1：10的供試液。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌數(shù)計數(shù)驗證試驗

2.3.1 試驗組

1）取規(guī)定量供試液，置無菌條件離心（500轉/分）3分鐘，取上清液置無菌試管中，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液補至原量，混勻后取1mL加至100mLpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，加青霉素酶一支，混勻，按中國藥典2010版附錄微生物限度檢查法中薄膜過濾法進行過濾，單膜沖洗量300mL，并在最后100mL沖洗液中加入相應試驗菌液1mL，沖洗后取出濾膜，菌面朝上，貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，置規(guī)定條件下培養(yǎng)，每株試驗菌平行制備2個平皿。

2）霉菌、酵母菌計數(shù)：采用中和法。取供試液1mL加至平皿中，加青霉素酶一支，試驗菌液1mL，注入玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基15～20mL，置規(guī)定條件下培養(yǎng)，每株試驗菌平行制備2個平皿。

2.3.2 菌液組：取制備好的各菌液1mL，分別加入平皿中，分別加營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20mL和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基15～20mL，置規(guī)定條件培養(yǎng)，測定所各試驗菌數(shù)。每株試驗菌制備2個平皿。

2.3.3 供試品對照組：取規(guī)定量供試品，方法同試驗組，加入相應培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿。

2.3.4 稀釋劑對照組：取稀釋劑1mL替代供試液，方法同試驗組，每株試驗菌平行制備2個平皿。

2.3.6 培養(yǎng)：細菌計數(shù)平板30～35℃培養(yǎng)3天；霉菌、酵母菌計數(shù)平板23～28℃培養(yǎng)5天，逐日點計菌數(shù)。

2.3.7 判斷標準：稀釋劑對照組及試驗組的菌回收率應≥70%。三次試驗結果見表1、表2、表3。

表1 第一次試驗細菌、霉菌及酵母菌數(shù)驗證結果

表2 第二次試驗細菌、霉菌及酵母菌數(shù)驗證結果

2.4 控制菌檢查方法驗證

2.4.1 試驗組：取供試液10mL，置無菌條件離心（500轉/分）3分鐘，取上清液置無菌試管中，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液補至原量，混勻后轉入100mLpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，加青霉素酶一支，混勻，按中國藥典附錄“微生物限度檢查法”中薄膜過濾法進行過濾，沖洗量單膜300mL，在最后100mL沖洗液中加入相應試驗菌液1mL，沖洗后取出濾膜，放至100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。取培養(yǎng)物0.2mL接種至5mLMUG培養(yǎng)基的試管內，培養(yǎng)，于5小時、24小時在366nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。若管內培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。沿培養(yǎng)管的管壁加數(shù)滴靛基質試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質陽性；呈試劑本色，為靛基質陰性。本底對照應為MUG陰性和靛基質陰性。

表3 第三次細菌、霉菌及酵母菌數(shù)驗證結果

2.4.2 陰性對照組：方法同試驗組，加入1mL陰性菌（即金黃色葡萄球菌液，濃度同細菌數(shù)驗證）。

三次試驗結果列表表示相同，統(tǒng)一列表見表4。

2.5 結果判斷2.5.1 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)驗證結論：在三次獨立平行試驗中，稀釋劑對照組菌的回收率均＞70%，試驗組菌的回收率均＞70%，可照此方法測定頭孢地尼的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)。

表4 三次試驗控制菌驗證結果

2.5.2 控制菌驗證結論：在三次獨立平行試驗中，陰性對照組未檢出陰性對照菌，試驗組檢出陽性試驗菌，可照此法進行頭孢地尼的控制菌檢查。

3 討論

結果表明，頭孢地尼采用上述方法進行微生物限度檢查，霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)測定采用中和法，細菌數(shù)測定采用低速離心（500轉/分）3分鐘、薄膜過濾（每膜沖洗300mL，并加入青霉素酶1支）的方法時，各試驗菌的回收率均＞70%，控制菌檢查采用低速離心低速離心（500轉/分）3分鐘、薄膜過濾（單膜沖洗300mL，并加入青霉素酶1支）。根據(jù)中國藥典2010年版的相關規(guī)定，此法適用于頭孢地尼的微生物限度檢查。

［1］中國藥典[M].2010年版.