大葉蛇葡萄不同提取物總黃酮含量測定*

何梟宇，楊若婧，朱志凱，江燦，張秀橋，，劉焱文

(1.湖北中醫藥大學藥學院，武漢430065;2.湖北中醫藥大學中藥資源與中藥化學重點實驗室，武漢430061)

大葉蛇葡萄中蛇葡萄素、楊梅素、楊梅苷等黃酮類成分具有降血壓等活性[1-3]。為進一步開發利用大葉蛇葡萄資源，筆者采用乙醇加熱回流法和滲漉法制備大葉蛇葡萄提取物，并對其不同提取物中總黃酮含量進行比較研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器SHIMADZU UV-1800分光光度計(日本島津公司)，RE-3000旋轉蒸發儀(上海亞榮公司)，分析天平(瑞士Metiler Toledo公司)，HH-4數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)。

1.2 試藥蛇葡萄素對照品(本實驗室自制，高效液相色譜歸一法確定其純度為98%)，三氯化鋁，95%乙醇等試劑均為分析純。大葉蛇葡萄(采于湖北省來鳳縣，經湖北中醫藥大學藥學院張秀橋鑒定為Ampelopsis megalophyllaDiels et.Gilg)在陰涼處干燥，粉碎后置干燥處備用。

2 方法與結果

2.1 不同提取物的制備稱取大葉蛇葡萄藥材100 g，置圓底燒瓶，以70%乙醇回流提取兩次(分別1和0.5 h)，合并兩次提取液，濾過、減壓回收乙醇，水浴揮去殘余水分后干燥即得。稱取大葉蛇葡萄藥材100 g，置滲漉提取器中，用70%乙醇浸泡24 h后，以2 mL·min－1速率開始滲漉，收集滲漉液，濾過、減壓回收乙醇，水浴揮去殘余水分后干燥即得。

2.2 對照品與供試品溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取60℃干燥至恒重的蛇葡萄素對照品，加95%乙醇，制成每毫升含0.101 mg的溶液，作為蛇葡萄素對照品溶液。

2.2.2 樣品溶液的制備精密稱取大葉蛇葡萄回流法提取物40.00 mg，置50 mL量瓶，以95%乙醇溶解并定容至刻度，即得大葉蛇葡萄回流法提取物樣品溶液。另精密稱取大葉蛇葡萄滲漉法提取物40.00 mg，置50 mL量瓶，以95%乙醇溶解并定容至刻度，即得大葉蛇葡萄滲漉法提取物樣品溶液。

2.3 測定波長的選擇精密吸取對照品溶液3 mL、回流法提取物樣品溶液5 mL，分別置于10 mL量瓶，加5%三氯化鋁溶液3 mL，再加95%乙醇定容至刻度，搖勻，放置40 min，以相應試劑作空白，進行全波長掃描，選擇最大吸收波長311 nm為測定波長。

2.4 線性關系考察精密吸取對照品溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL分別置于10 mL量瓶，加入5%三氯化鋁溶液3 mL，加95%乙醇至刻度，搖勻，放置40 min，以相應試劑作對照，在311 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(Y)、濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線，得回歸方程為:Y=59.142X+0.023 4，r=0.999 8(n=5)。結果表明蛇葡萄素在0.004～0.012 mg·mL－1范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.5 精密度實驗精密吸取同一對照品溶液0.8 mL，按“2.4”項方法測定吸光度6次。結果RSD為1.37%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性實驗精密吸取同一供試品溶液，按“2.4”項方法，分別在0，0.5，1，2，3，4 h測定吸光度。考察其在4 h內的穩定性。結果RSD為1.54%，表明供試品溶液在4 h內穩定。

2.7 重復性實驗精密稱取同一批大葉蛇葡萄回流法提取物6份，按“2.2.2”項方法平行制備，按“2.4”項方法，分別測定吸光度。結果RSD為1.39%，表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率實驗精密稱取6份已知含量的大葉蛇葡萄回流法提取物各20.00 mg，分別置于50 mL量瓶，分別向其中加入一定量的蛇葡萄素對照品，按“2.4”項方法，分別測定吸光度，并計算平均回收率。結果見表1。平均加樣回收率99.36%，RSD=1.59%。

表1 總黃酮加樣回收率實驗結果Tab.1Result of recovery of total flavonoid

2.9 大葉蛇葡萄回流法和滲漉法提取物總黃酮含量測定分別精密稱取大葉蛇葡萄回流法和滲漉法提取物適量各4份，置50 mL量瓶，以95%乙醇溶解并定容至刻度，按照“2.4”項方法測定吸光度，并計算總黃酮含量。結果見表2，3。回流法和滲漉法提取物總黃酮平均含量分別為640.74%和672.38 mg·g－1。

表2 大葉蛇葡萄回流法提取物總黃酮含量測定結果Tab.2Determination of tolal flavonoid in the extracts of Ampelopsis megalophyua by reflux method

表3 大葉蛇葡萄滲漉法提取物總黃酮含量測定結果Tab.3Result of determination of total flavonoid in the extracts of Ampelopsis megalophyua by percoteation method

3 討論

本實驗采用紫外分光光度法[4-6]，測定大葉蛇葡萄提取物中總黃酮含量，精密度、穩定性、重復性均符合要求，此方法準確可靠，可用于該藥用植物提取物總黃酮的測定方法。實驗結果表明，以蛇葡萄素計，滲漉法提取物中總黃酮的含量略高于回流法。本實驗為進一步研究制備大葉蛇葡萄標準提取物和建立其質量評價體系提供了科學依據。

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