高效液相色譜-蒸發光散射法測定扶正強筋片中黃芪甲苷含量*

謝委，方建國，杜光，王文清，施春陽，萬進

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院藥學部，武漢430030)

扶正強筋片由黃芪、升麻和黨參等多味中藥組成，有扶正固本、強筋健力、補腎健脾之功效，臨床適用于脾虛氣弱、脾腎陽虛、脾腎氣陰兩虛等重癥肌無力患者。自20世紀70年代起，扶正強筋片在我院神經內科、中醫科、兒科廣泛應用，累計使用上萬例次，是治療重癥肌無力的安全、有效的輔助藥物，目前尚未發現明顯不良反應[1-3]。黃芪為該方君藥，黃芪甲苷是黃芪的主要有效成分。實驗證明，黃芪甲苷能抑制外周血單核細胞體外分泌重癥肌無力患者血清中存在的煙堿型乙酰膽堿受體抗體[4]。筆者采用高效液相色譜法-蒸發光散法(HPLC-ELSD)法測定該藥中黃芪甲苷的含量[5]，該方法簡便靈敏，重復性好。通過方法學系統考察和10批樣品含量測定，建立了該藥含量測定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器美國Waters510型高效液相色譜儀，Alltech3300型蒸發光散射檢測器，AUW220D型雙量程分析天平(日本島津)。

1.2 試藥扶正強筋片(本院自制，批號:100315，100329，100331，100401，100419，100421，100422，101115，101117，101118)，黃芪甲苷(中國藥品生物制品檢定所，批號:0781-200109，供含量測定用)，乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱:Licrosorb C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);流動相:乙腈-水(34∶66);流速:0.8 mL·min－1;氣體流速:1.6 L·min－1;檢測器漂移管溫度:49℃;增益:4。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含0.125 mg和每毫升含0.5 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液取本品20片，除去糖衣，精密稱定，研細，取約3 g，精密稱定，加甲醇50 mL，加熱回流提取2 h，放冷至室溫，濾過，用少量甲醇分次洗滌容器和殘渣，合并洗液與濾液，蒸干，殘渣加水30 mL，微熱使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，用甲醇溶解并轉移至5 mL量瓶內，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對照溶液取不含黃芪的空白樣品，按“2.2.2”項依法制備，即得陰性對照溶液。

分別取黃芪甲苷對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按擬定色譜條件進行測定，結果陰性樣品在黃芪甲苷峰保留時間處無干擾。

2.3 標準曲線的繪制精密稱取黃芪甲苷對照品10.34 mg，置10 mL量瓶，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻;精密量取上述溶液0.5，1，2，5 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻;分別精密吸取上述對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積的自然對數(A)為縱坐標，以對照品濃度的自然對數(C)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為:A=1.412 2C+16.625，r=0.999 5，結果表明黃芪甲苷在0.052～1.034 mg·mL－1范圍內線性關系良好。

2.4 精密度實驗

2.4.1 重復性實驗選擇同一批號扶正強筋片(批號:100315，下同)，參照“2.2.2”項方法平行制備6份供試品溶液，測定峰面積并計算含量。結果平均每片扶正強筋片中黃芪甲苷含量為0.12 mg，RSD=2.06%。

2.4.2 中間精密度實驗在不同時間由不同分析人員取本品，按照“2.3”項下制備方法制備3份供試品溶液。按照上述色譜條件，測定峰面積。計算含量，即得。結果含量RSD為0.75%。

2.5 穩定性實驗取本品，參照“2.2.2”項方法制成供試品溶液，于室溫(20～25℃)下放置，在0，2，4，12，24 h分別精密吸取10 μL，按上述色譜條件測定峰面積，RSD為2.73%。說明供試品溶液在放置24 h穩定。

2.6 加樣回收率實驗取本品，參照“2.2.2”項方法取樣量的一半，精密稱取該粉末9份(每份約1.5 g)，分別添加0.098 4 mg·mL－1黃芪甲苷對照品溶液5，7，8 mL，每個梯度平行3份;按照含量測定所述方法進行制備，取樣測定峰面積并計算回收率，結果見表1。平均回收率(RSD)分別為102.2%(1.00%)，99.1%(1.36%)，102.4%(1.49%)。回收率良好，該方法可行。

表1 黃芪甲苷加樣回收率實驗結果Tab.1 Results of recovery astragaloside IV

2.7 范圍取本品，參照“2.2.2”項方法制備高濃度和低濃度供試品溶液各3份，取樣，測定，計算含量，結果見表2。

表2 范圍實驗結果Tab.2 Results of range test

可見樣品在60%～140%范圍內測定結果的精密度良好。

2.8 耐用性實驗

2.8.1 不同色譜柱比較取“2.4.1”項供試品溶液，按照“2.1”項色譜條件，使用Kromasil C18和Shim-pack Vp-ODS色譜柱，測定供試品溶液中黃芪甲苷的含量。RSD為4.65%，表明色譜柱對該方法的耐用性良好。

2.8.2 不同流動相比例比較取“2.4.1”項供試品溶液，使用乙腈-水(32∶68)和乙腈-水(36∶64)兩種不同比例的流動相，測定供試品溶液中黃芪甲苷的含量。RSD為4.64%，表明本方法對于流動相比例的耐用性較強。

2.8.3 不同溫度比較取“2.4.1”項供試品溶液，注入液相色譜儀，使用44和54℃不同的檢測器漂移管溫度，測定供試品溶液中黃芪甲苷的含量。RSD為2.26%，表明本方法對于檢測器漂移管溫度的耐用性較強。

2.9 樣品測定分別取10批樣品，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，測定，計算，結果10批樣品中最高含量為每片0.20 mg，最低含量為每片0.11 mg。可見不同批次黃芪質量有差異，導致所得制劑中黃芪甲苷的含量也有差異。故建立本含量測定方法來控制扶正強筋片的質量很有必要。

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇根據黃芪甲苷易溶于水、熱甲醇和乙醇，在含水正丁醇中有較大的溶解度的理化性質[6]，筆者在本實驗中先用甲醇提取，再用水飽和的正丁醇萃取，其中制劑中還含有氨基酸、多糖和酸性物質，可采取堿水處理，選擇氨試液除雜。

3.2 提取方法的選擇筆者曾比較了《中華人民共和國藥典》2010年版一部黃芪含量測定項下供試品溶液通過大孔吸附樹脂除雜的處理方法和省略使用大孔吸附樹脂除雜步驟的處理方法。兩種方法所得黃芪甲苷的含量一致。且后者所得供試品溶液雜質含量并未明顯增多，黃芪甲苷色譜峰能與其他組分達到基線分離，不影響含量測定的準確性，樣品處理時間明顯縮短。故最終選擇后者作為本品的供試品溶液處理方法。

[1]楊明山，蔡玉祥，徐金枝，等.扶正強筋片治療重癥肌無力療效觀察和AchRab的測定[J].同濟醫科大學學報，1993，22(增刊1):30－31.

[2]尹銀嘉，蔡玉祥，楊明山.扶正強筋片的制備、含量測定及臨床應用[J].中國藥科大學學報，1998，28(2):107－108.

[3]潘鄧記，楊明山，蔡玉祥.中西醫結合治療重癥肌無力的臨床觀察[J].中國中西醫結合雜志，2001，21(1):64－65.

[4]涂來慧，黃德仁，張仁琴，等.黃芪皂苷及補中益氣復方對重癥肌無力體外合成煙堿型乙酰膽堿受體抗體的調節作用[J].第二軍醫大學學報，1992，13(3):216－220.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:283.

[6]吳立軍.天然藥物化學[M].4版.北京:人民衛生出版社，2003:292.