固相萃取離子色譜法測定反義寡核苷酸藥物雜質*

馬金平，仲婕，魯丹丹，張金鐘，施明珠，高嬋，朱德領

(1.杭州天龍藥業有限公司，310021;2.軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所，北京100850)

反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides)是一種新型抗腫瘤和抗病毒的靶向治療藥物，由固相合成而得成品。由于在合成和工藝中使用了醋酸(acetic acid，MCAA)、二氯乙酸(dichloroacetic acid，DCAA)等溶劑，純化工藝中使用了氯化鈉，因此有必要建立寡核苷酸原料藥中雜質MCAA、DCAA和氯離子(Cl－)的質控方法。目前通用的有機殘留測定方法來自于ICH和《中華人民共和國藥典》2010年版氣相色譜法(GC)[1]，由于MCAA極性大，沸點較高，需要對樣品進行衍生化處理，定量結果變異較大，《中華人民共和國藥典》2010年版又收載了MCAA殘留的液相色譜方法[1]，筆者經實驗后發現峰形不好、檢測限高，長期用于生產化藥物控制對色譜柱有一定損耗;對含鹵素的殘留溶劑DCAA，GC-FID法靈敏度低，GC-ECD則會受氧元素影響。MCAA和DCAA都是能夠離子化的化合物，可在水中離解，離子色譜(IC)是較好的選擇，早期國內有文獻報道用梯度淋洗IC法分析DCAA和MCAA[2-3]，筆者采用IC等度分析，同時測定寡核苷酸原料藥中的雜質MCAA、DCAA和Cl－的含量，方法簡單，快捷可靠，線性范圍寬，所需試劑少，檢測靈敏度高，可為建立ASON質量標準提供技術參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器美國Dionex公司ICS-900型離子色譜儀，抑制型電導檢測器，Chromeleon色譜工作站。分析柱:Ionpac AS23(4 mm×250 mm)，保護柱:Ionpac AG23(4 mm×50 mm)。美國Agilent 6890N氣相色譜儀，色譜柱:HP-5(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。C18固相萃取小柱:WAT020805，Waters Sep-pak C183cc/500 mg。

1.2 試藥碳酸氫鈉(NaHCO3，Fluka分司生產，批號:0001446842，色譜純)，無水碳酸鈉(Na2CO3，天津市化學試劑研究所生產，優級純，含量≥99%)，二氯乙酸(Sigma-Alorich公司生產，批號:STBB5017，純度≥99%)，氯離子標準溶液(1 000 mg·L－1，購自國家標準物質研究中心)，甲醇(MERCK生產，含量≥99.9%，色譜純)，冰醋酸和濃硫酸均為分析純，實驗中所用的水由Millipore公司Simplieity生產，電阻率＞18.2 MΩ·cm－1的去離子超純水。寡核苷酸樣品由軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所九室提供(FLU批號:20100415，20100420，20100512;CT102批號:20110113-1，20110113-2，20110113-3)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件陰離子色譜分析柱Ionpac AS23(4 mm×250 mm);陰離子色譜保護柱Ionpac AG23(4 mm×50 mm);流動相:0.8 mmol·L－1NaHCO3/4.5 mmol·L－1Na2CO3;電導檢測;流速1 mL·min－1;抑制器的抑制電流為25 mA;進樣量10 μL。

2.2 對照品儲備液的制備

2.2.1 MCAA對照品儲備液的配制精密量取MCAA適量，用水定量稀釋制成每毫升含MCAA 0.4 μg的溶液，置4℃冰箱備用。

2.2.2 DCAA對照品儲備液的配制精密量取DCAA適量，用水定量稀釋制成每毫升含DCAA 0.156 μg的溶液，置4℃冰箱備用。

2.2.3 Cl－標準溶液1 000 mg·L－1，購自國家標準物質研究中心。

2.3 樣品溶液的制備精密稱取樣品100 mg，置10 mL量瓶，用水稀釋至刻度，用C18固相萃取小柱過濾，即得。

2.4 系統適應性實驗取一定濃度的對照品溶液、樣品溶液、加對照品的樣品溶液，按照“2.1”項色譜條件，各進樣10 μL，記錄圖譜。結果樣品中可能含有的化合物均可實現分離，且分離良好。MCAA與Cl－分離度10.26;DCAA與Cl－分離度4.56;理論板數:MCAA 6 173，DCAA 8 143，Cl－9 659;不對稱因子:MCAA 1.39，DCAA1.10，Cl－1.15;精密度:MCAA RSD為3.47%，DCAA RSD為0.8343%，Cl－RSD為1.54%。

2.5 標準曲線的繪制

2.5.1 MCAA標準曲線的繪制精密量取MCAA對照品儲備液適量，用水分別稀釋成0.002，0.004，0.04，0.2，0.4 μg·mL－1標準溶液，分別進樣10 μL，記錄色譜圖，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，計算回歸方程，MCAA:Y=5.230 7X+0.014(r=0.999 7)。結果MCAA在0.002～0.400 μg·mL－1濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.5.2 DCAA標準曲線的繪制精密量取DCAA對照品儲備液適量，用水分別稀釋成0.000 624，0.003 12，0.006 24，0.031 2，0.156 μg·mL－1標準溶液，分別進樣10 μL，記錄色譜圖，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，計算回歸方程，DCAA:Y=19.762X－0.007 2(r=0.999 9)。結果表明DCAA在0.000 624～0.156 μg·mL－1濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.5.3 Cl－標準曲線的繪制精密量取Cl－標準溶液適量，用水分別稀釋成0.002 4，0.024，0.06，0.3，1.5 mg·mL－1的標準溶液，分別進樣10 μL，記錄色譜圖，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，計算回歸方程，Cl－:Y=507.4X－0.746 2(r=0.999 8)。結果表明Cl－在2.4×10－3～1.5 mg·mL－1范圍內呈良好的線性關系。

2.6 精密度實驗取一定濃度的MCAA、DCAA、Cl－對照品溶液，每次進樣10 μL，重復進樣6次，測得峰面積，MCAA RSD為3.47%(n=6)，DCAA RSD為0.83%(n=6)，Cl－RSD為1.54%(n=6)。

2.7 靈敏度實驗

2.7.1 檢測限的測定將MCAA對照品溶液逐步稀釋，測得MCAA的檢測限為0.02 ng·mL－1(S/N=3);將DCAA對照品溶液逐步稀釋，測得DCAA的檢測限為0.312 ng·mL－1(S/N=3);將Cl－對照品溶液逐步稀釋，測得Cl－的檢測限為0.01 μg·mL－1(S/N=3)。

2.7.2 定量限的測定將MCAA對照品溶液逐步稀釋，測得MCAA的定量限為1 ng·mL－1(S/N=10);將DCAA對照品溶液逐步稀釋，測得DCAA的定量限為0.78 ng·m L－1(S/N=10);將Cl－對照品溶液逐步稀釋，測得Cl－的定量限為0.04 mg·mL－1(S/N=10)。

2.8 穩定性實驗取MCAA、DCAA、Cl－對照品溶液各1份，于室溫0，2，4，6，8，10 h后分別進樣10 μL，測得峰面積，MCAA的RSD為1.53%，DCAA的RSD為1.88%，Cl－的RSD為1.07%。可見對照品溶液在10 h內穩定。

2.9 IC法與GC法測定MCAA與DCAA的比較研究GC方法:毛細管柱頂空進樣系統程序升溫法。儀器:美國Agilent 6890N氣相色譜儀，色譜柱:HP-5(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。色譜條件:柱溫采用程序升溫:初溫35℃，維持2 min，以20℃·min-1的速率升溫至135℃，再以30℃·min-1的速率升溫至285℃，維持3 min;進樣口溫度為280℃;檢測器溫度為270℃;載氣為氫氣，采用分流進樣模式，分流比8∶1，柱流速1.2 mL·min－1。頂空瓶平衡溫度為80℃，平衡時間為120 min。頂空進樣40 μL，記錄色譜圖。對照品溶液:精密量取MCAA 119 μL和DCAA 80 μL，置25 mL量瓶，用甲醇溶解稀釋至刻度，精密量取1 mL置10 mL量瓶，用甲醇稀釋至刻度，作為對照品溶液。

樣品衍生:取本品適量，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋成為100 mg·mL－1的樣品溶液，取此溶液1.0 mL，置頂空瓶中，加入對照品溶液1.0 mL，加入濃硫酸0.5 mL，封蓋，置于85℃下反應8 h以上。進樣:在最佳的頂空條件下(80℃，120 min)使達到氣液平衡，手動移取頂空蒸氣40 μL進樣，結果見表1。

通過表1可以看出IC法較GC法精密度好，定量限、最小檢測限低，線性范圍寬。

2.10 樣品測定

2.10.1 樣品定量測定取樣品3批，按“2.3”項下方法制備樣品溶液，進樣10 μL，按“2.1”項色譜條件測定，記錄色譜圖。

2.10.2 樣品限度檢查精密量取MCAA 7.5 μL置50 mL量瓶，用水稀釋至刻度，作為MCAA對照品溶液;精密量取DCAA 4.8 μL置50 mL量瓶，用水稀釋至刻度，作為DCAA對照品溶液;精密量取Cl－標準溶液1.5 mL置50 mL量瓶，用水稀釋至刻度，作為Cl－對照品溶液。精密量取上述3種溶液各5 mL，搖勻，進樣10 μL，按“2.1”項色譜條件測定。

3 討論

樣品中可能含有MCAA、DCAA和Cl－雜質，筆者所選擇的色譜系統中，Cl－位于兩個殘留溶劑MCAA與DCAA之間，3個峰共存情況下，分離度能達到《中華人民共和國藥典》2010年版要求，實現完全分離，且可分別定量。

采用該IC法測定寡核苷酸原料藥中雜質MCAA、DCAA、Cl－的含量，方法學的線性范圍寬、精密度、靈敏度結果都較滿意，既能滿足殘留限度檢查的需要，又能在一定范圍內作定量分析。

該方法一次進樣即可準確定量樣品中MCAA(tR=4.757 min)、Cl－(tR=7.540 min)和DCAA(tR=8.977 min)的含量，對于硫代修飾的寡核苷酸(可能有磷酸鹽和硫酸鹽)，還可以同時測定PO3－4(tR=19.130 min)和SO2－4(tR=21.427 min)的含量，所需試劑少，方法簡單、快捷，為固相合成多肽和固相合成寡核苷酸藥品雜質控制提供了可靠易行的方法。

根據殘留溶劑的限度規定[1]:MCAA 0.5%，DCAA 0.5%，寡核苷酸原料藥企業內控標準規定Cl－含量應不高于0.1%，按限度配制對照品溶液和供試品溶液，各組分峰面積小于限度規定的對照品峰面積，且FLU樣品中MCAA、DCAA、Cl－平均含量分別為0%，0%，0.000 048%，CT102樣品中MCAA、DCAA、Cl－平均含量分別為0%，0%，0.000 08%，說明樣品雜質在《中華人民共和國藥典》和2010年版企業內控規定的限度范圍內。

表1 IC法和GC法測定MCAA與DCAA比較Tab.1The comparative study of IC and GC for determination of MCAA and DCAA

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄55，61－65.

[2]桂建業，張琳.離子色譜法測定飲用水中的5種鹵代乙酸[J].色譜，2008，26(1):119－121.

[3]LEON B，BRETT P.Use of temperature programming to improve resolution of inorganic anions，anions，haloacetic acids andoxyhalides in drinking water by suppressed ion chromatography［[J].J Chromatography A，2005，1072(2):207－215.