氧化苦參堿對(duì)結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸黏膜NOD2與TNF-α的影響*

唐慶，范恒，胡慧，壽折星，劉星星

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢430022)

近年來(lái)，我國(guó)炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)尤其是潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。該病治療難度大，愈后易復(fù)發(fā)，被世界衛(wèi)生組織列為難治病之一。UC發(fā)病與環(huán)境、遺傳、腸道黏膜免疫功能失調(diào)等多種因素有關(guān)。NOD2蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)病原相關(guān)模式識(shí)別受體(PRRs)，NOD2能識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞膜酸二肽，介導(dǎo)核因子κB(neclear factor-κB，NF-κB)的激活與α腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)等的表達(dá)[2-3]。已有研究表明，NOD2蛋白與UC發(fā)病密切相關(guān)[4-5]。筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用三硝基苯磺酸(trinitrobenzene-sulfonic acid，TNBS)制備大鼠UC模型，采用氧化苦參堿(oxymatrine，OMT)治療，檢測(cè)大鼠結(jié)腸黏膜NOD2和TNF-α表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料雄性SPF級(jí)SD大鼠32只，體質(zhì)量(250±20)g，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCKY(鄂)2004-0007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(鄂)2004-0028。TNBS購(gòu)自Sigma公司(批號(hào):P2297)。NOD2山羊抗鼠多克隆抗體購(gòu)自SANTA CRUZ公司。大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司。美沙拉嗪由法國(guó)愛(ài)的發(fā)制藥集團(tuán)生產(chǎn)。苦參素注射液(有效成分為OMT)由天津市生物化學(xué)制藥廠生產(chǎn)，OMT純度達(dá)98%。

1.2 動(dòng)物分組將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、OMT組、美沙拉嗪組，每組8只。對(duì)照組從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束正常飲水、喂食，其他3組用TNBS造模。造模后24 h，模型組肌內(nèi)注射等體積0.9%氯化鈉溶液;OMT組給予OMT肌內(nèi)注射，63 mg·kg－1·d－1[6];美沙拉嗪組給予美沙拉嗪純化水溶液灌胃，0.42 g·kg－1·d－1，均給藥15 d。第16天開(kāi)始，禁食24 h后處死大鼠。

1.3 造模方法大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，禁食不禁水24 h，10%水合氯醛按0.3 mL·(100 g)－1腹腔注射麻醉。將直徑2.0 mm橡膠輸液管由肛門(mén)輕緩插入8 cm，將5%TNBS液(TNBS溶于50%乙醇)0.6 mL用注射器緩慢推入橡膠導(dǎo)尿管，注入TNBS液后將大鼠尾巴提起，持續(xù)倒置30 s，然后使大鼠平躺，自然清醒后自由飲食。

1.4 結(jié)腸黏膜標(biāo)本的制備將大鼠頸椎脫位處死，仰位固定于手術(shù)臺(tái)，切取肛門(mén)至回盲部結(jié)腸，取出結(jié)腸后沿縱軸切開(kāi)，并用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，觀察大鼠結(jié)腸黏膜的病變損傷程度，然后立即用4%多聚甲醛溶液固定，由本院病理室石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下評(píng)估黏膜損傷程度。

1.5 結(jié)腸黏膜NOD2的檢測(cè)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)腸黏膜NOD2表達(dá)，組織切片脫蠟，修復(fù)抗原，切片放入3%過(guò)氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15 min，按稀釋度1∶150滴加山羊抗鼠NOD2多克隆抗體50 μL，4℃孵育過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)沖洗3次，滴加復(fù)合生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育20min，二氨基聯(lián)苯胺(diamionobenzidine，DAB)顯色，顯微鏡下控制顯色程度，純化水終止顯色反應(yīng)，蘇木精復(fù)染30～60 s，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)物，彌漫分布于黏膜固有層及部分上皮內(nèi)，在40倍鏡下選取典型視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，記數(shù)其中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并以率表示。

1.6 結(jié)腸黏膜TNF-α的檢測(cè)取大鼠結(jié)腸黏膜標(biāo)本，用載玻片輕刮腸黏膜表面黏液，再置于上清液中清洗，繼用載玻片用力刮取腸黏膜組織標(biāo)本，將標(biāo)本轉(zhuǎn)入勻漿器中，加入3倍0.9%氯化鈉溶液充分勻漿，4℃1 000×g離心10 min，取上清液檢測(cè)。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出各標(biāo)本TNF-α的濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況對(duì)照組大鼠體質(zhì)量、大便、飲食、活動(dòng)正常，其余組大鼠于灌腸后第2，3天開(kāi)始出現(xiàn)明顯稀便、黏液膿血便、體質(zhì)量減輕及活動(dòng)度明顯下降。OMT組大鼠治療4～5 d后腹瀉、膿血便明顯減輕，體質(zhì)量及活動(dòng)度較對(duì)照組略有下降，但明顯輕于模型組。模型組大鼠死亡1只，解剖尸體可見(jiàn)結(jié)腸黏連、狹窄。

2.2 結(jié)腸大體形態(tài)及組織病理評(píng)分對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜基本正常，模型組大鼠結(jié)腸黏膜充血水腫、糜爛壞死，可見(jiàn)多發(fā)小潰瘍及腸壁黏連，腸腔擴(kuò)張，腸壁增厚，病變部位以回盲部和結(jié)腸為主，部分可累及末端回腸，美沙拉嗪組和0MT組病變明顯減輕，可見(jiàn)充血、水腫、糜爛和紅色瘢痕[7]。將病變組織切片，HE染色，光鏡下觀察:模型組結(jié)腸黏膜高度水腫，上皮脫落、壞死，潰瘍形成，大量淋巴細(xì)胞和多核中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)至黏膜層、黏膜下層甚至肌層，肉芽腫形成，杯狀細(xì)胞減少;美沙拉嗪組結(jié)腸黏膜糜爛，黏膜下層水腫、充血，固有層大量中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下層水腫、充血;OMT組結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞增多，黏膜固有層可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)。各組大鼠結(jié)腸損傷和組織病理評(píng)分[8]見(jiàn)表1。

2.3 結(jié)腸黏膜NOD2蛋白表達(dá)光學(xué)顯微鏡下，大鼠結(jié)腸黏膜組織免疫組織化學(xué)切片可見(jiàn)結(jié)腸黏膜NOD2蛋白主要表達(dá)于上皮細(xì)胞和單核細(xì)胞。對(duì)照組結(jié)腸黏膜內(nèi)少量細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)淺黃色顆粒，模型組上皮細(xì)胞和單核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均可見(jiàn)大量深棕黃色或褐色顆粒，美沙拉嗪組和OMT組上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)少量黃色顆粒。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)顯示，模型組大鼠結(jié)腸黏膜NOD2蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)，美沙拉嗪組、OMT組大鼠結(jié)腸黏膜NOD2蛋白表達(dá)較模型組顯著降低(P＜0.05)(表1)。

2.4 結(jié)腸黏膜TNF-α表達(dá)模型組大鼠結(jié)腸黏膜TNF-α明顯升高(P＜0.01)，美沙拉嗪組、OMT組大鼠結(jié)腸黏膜TNF-α較模型組顯著降低(P＜0.05)(表1)。

3 討論

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎模型中，大鼠結(jié)腸黏膜NOD2蛋白過(guò)度表達(dá)，結(jié)腸黏膜TNF-α增多，這是TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎的重要機(jī)制之一。宿主細(xì)胞對(duì)入侵病原體的識(shí)別依靠表達(dá)在細(xì)胞表面或活細(xì)胞內(nèi)的能夠識(shí)別病原相關(guān)分子模式的受體介導(dǎo)。NOD2蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)病原相關(guān)模式識(shí)別受體。研究表明，NOD2能識(shí)別存在于革蘭陰性和革蘭陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁的胞壁酸二肽，調(diào)控NF-κB的激活，從而廣泛參與細(xì)胞內(nèi)病原微生物的識(shí)別和炎癥應(yīng)答的誘導(dǎo)，是聯(lián)系天然免疫與特異性免疫的重要橋梁[9-10]。NOD2蛋白是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白家族中的一員，編碼NOD2的基因位于人類染色體16q12。NOD2蛋白分子主要由3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域構(gòu)成:N端的胱冬酶募集域、位于中間的NOD域、C端的富亮氨酸重復(fù)序列域，其中NOD域包含P環(huán)和MgCl結(jié)合位點(diǎn)[11-12]。NOD2表達(dá)于單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、粒細(xì)胞和少量T細(xì)胞，腸道上皮細(xì)胞也有NOD2表達(dá)。研究表明，NOD2可以介導(dǎo)NF-κB活化，活化通路主要有受體相互作用蛋白-2和IκB激酶復(fù)合體參與。當(dāng)NOD2蛋白LRR域識(shí)別細(xì)菌產(chǎn)物后，可誘導(dǎo)蛋白分子間通過(guò)NOD域相互聯(lián)系進(jìn)行自身寡聚化反應(yīng)形成受體復(fù)合體，隨后受體復(fù)合體通過(guò)同型CARD-CARD相互作用將RIP2分子募集到周圍。RIP2與IκKγ亞基相連接，激活I(lǐng)κK酶復(fù)合體，引起IκB磷酸化，產(chǎn)生一系列效應(yīng)—降解磷酸化的IκB，NF-κB核易位、含κB位點(diǎn)的靶基因轉(zhuǎn)錄活化[13]。促進(jìn)多種炎性細(xì)胞因子如TNF-α的基因轉(zhuǎn)錄，這些炎性細(xì)胞因子可促進(jìn)NF-κB進(jìn)一步活化，通過(guò)正反饋使炎性細(xì)胞因子分泌增加，產(chǎn)生瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使炎癥過(guò)程得到放大和持續(xù)[14]。目前，已有許多實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明NOD2蛋白與IBD發(fā)病密切相關(guān)[5，15]，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用TNBS誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎模型進(jìn)一步驗(yàn)證了這種觀點(diǎn)。

表1 4組大鼠結(jié)腸損傷、組織病理評(píng)分與結(jié)腸黏膜NOD2、TNF-α表達(dá)測(cè)定結(jié)果Tab.1Colon lesion scores，histological score and expression of NOD2 and TNF-α in colon mucosa of 4 groups of rats x±s

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OMT對(duì)TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎有明顯的治療作用，可以減輕大鼠結(jié)腸黏膜損傷，改善結(jié)腸黏膜病理組織學(xué)評(píng)分，其機(jī)制與抑制結(jié)腸黏膜NOD2蛋白過(guò)度表達(dá)，降低大鼠結(jié)腸黏膜TNF-α有關(guān)。綜上所述，結(jié)腸黏膜NOD2蛋白過(guò)度表達(dá)、TNF-α分泌增多參與了UC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，而OMT可以通過(guò)抑制NOD2蛋白過(guò)度表達(dá)、降低TNF-α分泌，起到減輕結(jié)腸黏膜炎癥、保護(hù)腸黏膜的作用，可能是OMT治療UC的機(jī)制之一[16]。

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