環扎大鼠脊髓損傷早期不同時機減壓后光密度測量熱休克蛋白70的表達及其與神經細胞凋亡的相關性研究

顧文浩 胡嵐祥 徐祝軍 王緒成 汪紅林 謝家兵

脊髓損傷(SCI)的發病率隨著現代交通業的發展而升高，手術減壓治療急性SCI是一種切實可行的治療方法，但是在對SCI選擇傷后干預性手術治療時間點上，各臨床治療中心尚沒有達成共識［1］。為探討早期不同時機減壓療效，本實驗采用環扎法建立大鼠脊髓損傷模型，對損傷的脊髓早期減壓，應用免疫組化法觀察HSP70的表達及TUNEL陽性細胞數，光密度測量脊髓細胞的 HSP70表達陽性面積，觀察HSP70表達與神經細胞凋亡的關系，觀察早期減壓療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 84只雄性、13周齡、清潔級Sprague－Dawley大鼠，體重270～320 g，平均290.5 g。由浙江省實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(浙)20080033。使用隨機數字表、安全隨機法，分為4組。對照組即A組:僅行椎板切除，n=12，實驗組分為B組:8 h脊髓減壓，n=24;C組:72 h脊髓減壓，n=24;D組:環扎術后不行脊髓減壓術，n=24。分別于手術后 1 d、3 d、7 d、14 d、21 d 處死后取出脊髓標本。

1.2 主要試劑 (1)Rabbit Anti－Hsp70;(2)即用型SABC試劑盒;(3)細胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);(4)0.01PBS(PH7.2－7.4);(5)0.01枸櫞酸緩沖液(PH6.0);(6)DAB顯色試劑盒;(7)胃蛋白酶消化液(北京中杉金橋生物有限公司);(8)4%甲醛(皖醫弋磯山醫院實驗外科)。

1.3 動物模型建立 采用環扎法建立大鼠脊髓損傷模型［2］。以5－0普通白色絲線環扎大鼠胸腰段硬脊膜囊建立大鼠急性脊髓損傷壓迫模型。1%戊巴比妥鈉，30～40 mg/kg，大鼠腹腔內給藥麻醉，以T13棘突為中心，取后入路，咬除T13椎板。10倍顯微鏡下，用測量線環形測量硬脊膜囊周長，測出硬脊膜囊周長(C1)，經代數運算(C 2 =C1×)獲得將硬脊膜囊截面壓縮至原截面積70%的周長(C2)，將原測量平面將硬脊膜囊環扎至原截面積的70%。結扎后依層縫合。B組8 h脊髓減壓，取出環扎線;C組72 h脊髓減壓，取出環扎線。D組保留環扎線。術后常規護理。

1.4 標本采集、制備與HE染色 大鼠模型分別在手術減壓后 1 d、3 d、7 d、14 d、21 d 五個時間，將對照組和脊髓損傷組的大鼠經心臟灌注取材，灌注后脊髓已被多聚甲醛固定變硬，以環扎損傷部位為中心、取出其上下段共1.5 cm脊髓組織，浸泡于相同甲醛溶液中后固定72 h。損傷下端0.5 cm以4 μm厚度切片，脊髓取冠狀面，撈片于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，標簽晾干玻片分別行HE染色。

1.5 免疫組織化學染色 分別取脊髓損傷下端組織切片用Rabbit Anti－Hsp70抗體進行SABC免疫組織化學染色，使用DAB顯色試劑盒，TUNEL法觀察神經細胞的凋亡水平，使用DAB顯色試劑盒染色檢測，所有實驗步驟嚴格按照該試劑的標準和流程進行。使用數碼相機(NIKON－4300日本)對顯色的圖片攝像。

1.6 光密度測量 在普通光學顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察每組不同時間下染色特點。每一染色切片隨機取5個高倍視野(10×40)進行顯微攝影(Nikon Eclipse 80i顯微成像系統)獲取圖像，調試完成后，維持采集的各項設置不變，一次性采集出所有樣本的圖像，每張切片至少隨機采集5個視野。使用圖像分析軟件(Image－Pro Plus 6.0美國)對每張切片進行光密度測定。積分光密度(IOD)可反映所測結構的光密度與面積的綜合變化，IOD與物質的質量成正比，其數值反映物質的相對含量［3，4］。

1.7 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行數據分析，各組數據采用均數±標準差±s)表示，四組數據均呈正態分布，方差齊性檢驗采用比較均值單因素方差同性檢驗，組內組間比較采用一般線性模型單變量方差檢驗，HSP70陽性細胞數與神經細胞凋亡細胞數相關性采用直線相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HSP70積分光密度 使用圖像分析軟件(Image－Pro Plus 6.0美國)對每張切片進行光密度測定，在400倍每張切片至少隨機采集5個視野。A組偶見陽性面積，各時間點無顯著差異。陽性面積D組高于C組，C組高于B組，實驗組術后1 d陽性面積增加，術后3 d到達高峰，術后7 d有所降，術后21 d仍然有所表達。實驗組組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)，組內比較術后1 d、3 d、7 d差異有統計學意義(P＜0.05)，術后7 d、14 d、21 d比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 HSP70免疫組化陽性細胞數結果 光鏡下分別觀察各組各時間點脊髓損傷下端的組織變化，以細胞漿和(或)核棕黃色著色為陽性細胞，在400倍視野下每張切片于灰質取5個視野，分別計數每個視野的陽性細胞數。A組偶見免疫陽性細胞，各時間點無顯著差異(見圖1:A)。陽性細胞數，D組高于C組，C組高于B組，實驗組術后1 d免疫陽性細胞增加，術后3 d到達高峰，術后7 d有所降，術后21 d仍然有所表達。實驗組圖片見圖1:B、C、D、E、F。實驗組組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)，組內術后1 d、3 d、7 d比較差異有統計學意義(P＜0.05)，術后7 d、14 d、21 d比較差異無統計學意義(P＞0.05)。HSP70免疫陽性細胞數統計估算邊際均值見圖2。

2.3 Tunel凋亡細胞 凋亡細胞呈棕褐色和棕黃色，胞核固縮顆粒深染，形態不規則，為散在和彌散性分布于損傷區域及周圍。在400倍視野下每張切片于灰質取5個視野，分別計數每個視野的陽性細胞數。對照組少見凋亡細胞。凋亡細胞數，D組高于C組，C組高于B組，實驗各組術后1 d出現大量凋亡細胞，術后3 d達到高峰，術后7 d、14 d、21 d凋亡細胞逐日減少。各組組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)，組內術后1 d、3 d、7 d比較差異有統計學意義(P＜0.05)，術后7 d、14 d、21 d比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.4 HSP70陽性細胞與Tunel細胞凋亡的相關性分析 實驗組不同時間點熱休克蛋白70陽性細胞、tunel陽性細胞數比較差異均具有統計學意義，兩者線性相關系數r=0.685～0.971，對r值進行t檢驗的假設檢驗，P＜0.05，認為兩者成正相關。

3 討論

目前治療脊柱脊髓損傷的主要方法是及時徹底地減壓和恢復脊柱穩定性，減少繼發性損傷［1］。目前認為細胞凋亡是繼發性脊髓損傷的重要組成部分，繼發性脊髓損傷中出現的神經元和神經膠質細胞死亡都是繼發細胞凋亡的結果［5］。當發生脊髓損傷后局部熱休克蛋白(HSPs)的表達增加，可對抗脊髓繼發性損傷神經細胞凋亡是脊髓繼發性損傷的主要機制之一，HSPs可通過以下機制抑制神經細胞凋亡:抑制內源性(線粒體內caspase依賴的)凋亡途徑，抑制外源性(受體介導的)凋亡途徑，調節Bcl－2家族成員的活性促進核轉錄因子的活化，抑制一氧化氮(NO)的大量產生減少自由基的毒性作用［6］。其中HSP70屬于誘導型HSP70，其在正常細胞中不表達或表達量很少，但在應激源刺激下，表達量顯著增加［7］。實驗證實HSP70對細胞保護作用，其誘導的數量與保護作用的強弱呈正相關［8］。邵將等［9］實驗顯示，HSP70表達隨時間的延長逐漸增強，損傷后24～48 h達到頂峰，在此期間組織內所有細胞均可見HSP70的陽性表達，這種表達一直持續到損傷后72 h。與本次實驗HSP70表達的高峰期較為接近。由于HSP70屬于誘導型HSP，其誘導的機制尚不完全清楚，所以單純手術干預不能誘導其表達增加。因此在今后的研究中，對損傷的脊髓早期減壓的同時，短時間誘導出大量HSPs，達到更好地抗脊髓繼發性損傷神經細胞凋亡，將是未來治療脊髓損傷的新路徑。

圖1 熱休克蛋白70免疫組化圖片(400倍放大)

圖2 熱休克蛋白70的估算邊際均值

［1］楊民，徐祝軍，黨耕町．外科干預性手術治療時間的選擇對急性脊髓損傷預后影響的研究進展［J］．中國脊柱脊髓雜志，2009，19(4):310－313．

［2］徐祝軍，王兵，楊民．環扎法致大鼠脊髓損傷后早期不同時段減壓療效的評價［J］．中華實驗外科雜志，2011，28(7):1191 －1192．

［3］李濤，范好，劉芳．免疫組織化學圖像光密度分析的標準化方法［J］．解剖學雜志，2008，31(5):727 －728．

［4］李楓．圖像分析中光密度參數物理意義的正確理解和使用［J］．解剖學雜志，2009，32(2):271 －273．

［5］范留欣，馬龍，孫長山．大鼠脊髓損傷后MMP一9表達和細胞凋亡的研究［J］．中國醫學創新，2010，7(25):175 －176．

［6］李健輝，馮世慶．熱休克蛋白與脊髓損傷的相關性研究［J］．天津醫藥，2009，37(6):521 －523．

［7］朱林波，傅慶國．HSP70－PCs的抗腫瘤作用［J］．中華全科醫學，2011，9(8):1281 －1282．

［8］Sale hi AH，Morris SJ，Ho WC，et al．AEG3482 is an antiapoptotic compound that inhibits Jun kinase activity and cell deathth rough induced expression of heat shock protein70［J］．ChemBio，2006，13(2):213－223．

［9］邵將，賈連順，曹師鋒，等．熱休克蛋白70在大鼠急性打擊損傷脊髓中的表達［J］．脊柱外科雜志，2008，6(3):169 －172．