苜蓿假盤菌與苜蓿葉片親和性互作的超微結構特征

史娟，王華榮，鐘少林

（1.寧夏大學農學院，寧夏 銀川750021；2.西部土地退化與生態恢復國家重點實驗室培育基地，寧夏 銀川750021）

植物病原真菌引起寄主植物生病進而表現出癥狀，首先必須侵入寄主組織并在其體內生長，才能完成其侵染過程。因此，病原菌為了成功侵入發展了一系列的入侵及最大限度生長、繁殖及主動入侵的機制［1］。伴隨寄主病原互作過程的發生，寄主和病原菌相應的生理、生化、細胞及分子生物學過程隨之發生［2，3］。研究病原寄主兩者親和性互作的細胞學特征，從細胞角度闡明兩者互作機制，為進一步研究病菌致病的分子機理、信號識別等具有重要的理論意義。

苜蓿（Medicago sativa）作為一種優質飼草，是我國栽培面積最大的牧草之一［4］。因其特殊的固氮能力、較強的適應性，國內外學者從形態、細胞和分子生物學等方面進行了系統而深入的研究［5－8］。苜蓿褐斑病（普通葉斑病）是由苜蓿假盤菌（Pseudopeziza medicaginis）引致的葉部病害，廣泛分布于世界各主要苜蓿產區，是苜蓿生產中危害嚴重的葉部病害之一［9，10］。不僅造成牧草產量的損失，而且降低干草產品的品質。病菌侵染葉片形成平均直徑約2mm的褐色圓形略突起的點狀病斑，導致苜蓿葉片香豆雌酚等植物雌激素樣物質大量增加，常使得家禽采食后引起流產、不育等疾病［11，12］。有關該病害的研究，最近的研究涉及細胞和分子生物學領域，不僅闡明了苜蓿褐斑病菌的侵染過程［13，14］，而且獲得了一個與抗褐斑病基因相關的標記—M3E3－R169［15］。標志著苜蓿褐斑病的研究進入分子領域［16－18］。這些研究結果為苜蓿的抗病育種奠定了堅實的基礎。在苜蓿—苜蓿假盤菌互作系統中，作者應用細胞學方法研究了苜蓿假盤菌侵染苜蓿葉片的侵染過程［13］，但兩者親和性互作的超微結構特征未見系統報道。本研究從病菌侵染以及感病寄主組織的細胞學反應2個方面闡述兩者親和性互作的關系，為進一步闡明病菌侵入的分子機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 供試菌種、苜蓿品種及其培養、繁殖

苜蓿假盤菌由寧夏大學草業科學研究所提供。挑取平板上培養的苜蓿假盤菌菌落，制成菌落懸浮液，移入20%V8汁CaCO3培養基上擴繁。

供試感病苜蓿品種為德國大葉（M.sativa）由寧夏大學草業科學研究所提供，按常規方法種植于直徑為30 cm的花盆內，待二茬苜蓿生長至3周左右，避開嫰葉和老葉，選取生長一致的功能葉片，用滅菌水沖洗2遍后，置于底部鋪有保濕濾紙的培養皿內待用。

1.2 接種

每皿放入10個苜蓿葉片，采用逆向產孢培養法進行接種。將V8培養基上成熟的苜蓿假盤菌菌落挑出，移至底部鋪有濕潤濾紙的培養皿蓋上，于20℃黑暗條件下保濕4～6h，取出置于離體苜蓿葉片的正上方，利用子囊自然彈射進行接種，接種2～4h后將接種菌落移出。重復3次。為了保證離體葉片上有足夠的游離水，不定期的用滅菌水對接種后的離體葉片進行噴霧。

1.3 透射電鏡（TEM）樣品的制備與觀察

分別于接種后24h、48h、5d（癥狀初顯）、10d（中顯）和15d（病斑突破寄主表皮產生子囊盤）取樣，并將樣品切成0.3～0.5cm2的小塊，按康振生［19］的方法制備樣品。葉樣經抽真空后于4%戊二醛（磷酸緩沖液，pH 6.8，0.25mol／L）中前固定16h（4℃），緩沖液反復沖洗，于1%餓酸（磷酸緩沖液，pH 6.8，0.25mol／L）中后固定2h。系列丙酮脫水，Epon812環氧樹脂包埋，在40和60℃下分別聚合24和48h。樣塊進行修整后，超薄切片經醋酸雙氧鈾—檸檬酸鉛雙重染色，于JEM－1230型透射電鏡下觀察、拍照。

2 結果與分析

2.1 病菌侵入寄主的超微結構特征

電鏡觀察發現，苜蓿假盤菌侵入寄主組織后，病菌菌絲在結構和功能上發生了一系列的變化。接種24～36 h，菌絲直接進入寄主細胞，以胞內方式生長，并向相鄰的細胞擴展（圖1－1，2）。進入寄主胞內的病菌菌絲有著較厚的外壁，且周圍沉積電子致密度高的物質形成似菌絲鞘狀結構將菌絲包裹，菌絲中可見占據面積較大的液泡，多個菌絲的菌絲鞘可相互連接，且隨菌絲的擴展而延伸（圖1－4，5），菌絲分隔處明顯觀察到菌絲細胞液在流動（圖1－2）。擴展的胞間菌絲細胞壁比胞內菌絲明顯加厚（圖1－3）。菌絲在穿透臨近細胞時，菌絲外壁的某一個部位與寄主細胞壁緊密接觸，接觸點顏色加深，液泡移向接觸點似乎形成了較大的壓力幫助其穿過胞壁組織（圖2－7）。同時還觀察到，侵入寄主細胞內的菌絲并不立即穿透寄主質膜，而是利用質膜將其包圍，質膜突起部分沉積電子致密度高的物質，該區域隨菌絲的擴展而延伸（圖2－9，10，12）。胞內菌絲侵染葉綠體等細胞器時，菌絲鞘首先與葉綠體等細胞器膜相連（圖2－8，11），然后破壞和瓦解基粒片層結構，被瓦解的細胞器結構沿菌絲和胞壁周圍沉積（圖3－14，15）。隨著菌絲的擴展，菌絲鞘和包裹菌絲的質膜區域被降解（圖3－17），而不再具有完整性。

2.2 寄主細胞病理變化的超微結構特征

超微結構發現，伴隨病菌成功侵入、定殖和擴展，寄主細胞出現了一系列的病理變化特征。首先病菌侵入寄主細胞并在細胞內擴展發育，寄主原生質膜向內凹陷并形成突起，將侵入到寄主細胞內的菌絲包裹，菌絲與質膜始終是隔離的，寄主原生質膜和細胞壁之間沉積電子致密度深的物質，形成一個將病菌菌絲和寄主原生質膜隔開的界面層（圖1－2，圖2－10，11），這一現象表明寄主細胞膜的完整性遭到了攻擊，但病菌并未對寄主細胞質膜產生直接的破壞作用，從而使病原菌不斷地在原生質膜區域擴展。其次是菌絲體在寄主細胞內的不斷擴大，周圍的原生質膜也相應擴大其面積，始終將寄主原生質與菌絲體隔開。由于苜蓿褐斑病菌大部分的菌絲都是在寄主細胞內活動，因此，病菌和寄主細胞發生的一系列的營養、生物學及信號識別等都有可能發生在這一區域。當病菌菌絲擴展至質膜部位時，與其相鄰細胞細胞壁內側的質膜沉積電子致密度高的物質（圖3－13）。進一步觀察發現，沿交界面的外層排列了多個不等的液泡狀物，有些是直接嵌入在界面層的組織內（圖3－16）。隨著侵染時間的延長，寄主細胞內葉綠體是最先被降解的細胞器，隨后才是質膜的降解，多個細胞器被降解，降解物沉積在細胞壁和菌絲壁邊緣（圖3－19），在降解嚴重的寄主細胞內，形成一些結晶狀的顆粒物（圖3－20），隨著病菌菌絲的不斷擴展，大量胞內菌絲向胞外擴展，寄主完整的細胞結構消失，被病菌菌絲充滿（圖3－21）。

3 結論與討論

本研究利用電子顯微技術，研究了苜蓿假盤菌與苜蓿親和性互作過程的超微結構特征，首次從細胞角度揭示了兩者互作細胞學機制。為從分子生物學角度對其進行更深入的研究奠定了基礎。

圖1 侵入寄主細胞中的病菌菌絲的超微結構特征Fig.1 The ultrastructure of hyphal to invade the host cells

圖2 病菌菌絲在寄主細胞中的擴展以及對寄主質膜影響的超微結構特征Fig.2 Mycelial expansion in host cells and the effects ultrastructure of host plasma membrane

圖3 病菌侵染過程中寄主細胞表現出超微結構特征Fig.3 Ultrastructural features show during pathogen infect of host cells

在褐斑病菌侵入寄主細胞以及進一步的發育過程中，病菌菌絲穿透寄主細胞壁進入到寄主細胞內，在其發育和擴展的過程中，被內陷的寄主原生質膜所包圍，于是病菌菌絲與寄主質膜之間形成了一個較大的交界面，這一界面將病菌菌絲與原生質隔開，但這一界面，并不是自始至終都是存在的。在侵染早期，這一界面將菌絲包圍，并隨病菌菌絲的擴展而相應的也在擴大其面積，且多個菌絲的界面可以相互連接，且菌絲在擴展和侵染葉綠體等細胞器時，菌絲鞘首先與質膜和細胞器膜相連形成界面層。初步分析，病菌獲取營養物質、與寄主的相互識別、信息物質的交流等都有可能發生在這一界面。隨著侵染強度的增加，這一界面被降解。筆者認為，這一現象可以說明，病菌為了達到侵入且在胞內定殖的目的，避免寄主細胞抵御病原侵染產生的防御反應，或快速的細胞死亡，利用寄主原生質膜形成交界面，將菌絲與寄主原生質隔開，這一層界面基質可能是苜蓿褐斑病菌侵入寄主細胞存在的一個活體營養階段。由于白粉菌和霜霉菌等活體營養型真菌形成吸器進入寄主細胞，在吸器外膜和寄主細胞膜的界面之間形成界面基質將其分開，因此，界面基質的形成是大多數活體營養型真菌與寄主形成的一種共有現象［20］。而在炭疽菌的研究中，由于炭疽菌與寄主互作界面存在界面基質的現象，且與活體營養型真菌的界面基質相似，因此，菜豆炭疽菌（Colletotrichumlindemuthianum）被認為是具有活體和死體2個營養型階段的植物病原菌［21］。苜蓿假盤菌在侵入寄主后也具有和寄主原生質膜形成界面基質的階段，筆者根據電鏡觀察結果：苜蓿假盤菌在其侵染過程中，由于出現了一個類似與活體營養型真菌的界面基質階段，這一階段與菜豆炭疽病菌形成的界面基質也較類似，因此，初步認為苜蓿假盤菌的營養類型為半活體營養型真菌。

定殖在寄主細胞內的病菌菌絲，首先破壞的細胞器是葉綠體，這與robárová［14］報道的結果一致。隨后是膜的降解，伴隨質膜的降解，寄主細胞逐漸被瓦解。這一結果從細胞學角度解釋了為什么感染褐斑病的苜蓿葉片光合速率下降的原因之一。南志標等［22］研究了苜蓿褐斑病對牧草質量和光合速率影響，褐斑病使苜蓿病葉中粗蛋白含量顯著降低，與健葉相比，其含量減少25%，葉片光合速率隨病害嚴重度的增加而降低。

病菌早期形成界面層，說明界面層中的電子致密度物質可能與病菌的致病性有關。其次，隨病菌侵染強度增加，界面層外側排列了多個液泡狀物，并可見有的液泡狀物與界面層嵌合。初步分析它們可能與界面層的降解有關。這些沉積物及液泡狀物是受病菌誘導的還是寄主細胞早期的反應，有待于深入研究。

致謝：本論文中的研究內容在西北農林科技大學陜西省農業分子生物學重點實驗室完成，在此謹表謝意。

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