正交設(shè)計(jì)優(yōu)化山野豌豆SRAP－PCR反應(yīng)體系與引物篩選

劉穎，王顯國，張巨明＊，劉芳

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州510642；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京100193；3.全國畜牧總站，北京100193）

山野豌豆（Vicia amoena）又叫落豆秧、高蔓草藤、宿根苕子，為豆科巢菜屬多年生草本植物［1］。它表現(xiàn)出耐寒、抗旱、葉量大、粗蛋白及動(dòng)物必需氨基酸含量高、適應(yīng)性廣、再生力強(qiáng)、容易繁殖、產(chǎn)量高、品質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)［2－5］。另外，山野豌豆不僅是一種優(yōu)良牧草，而且還是很好的防風(fēng)固沙水保植物［6］、改土肥田綠肥作物［7］和草坪及藥用植物［8］，具有推廣和應(yīng)用價(jià)值。目前SRAP（sequence related amplified polymorphism）標(biāo)記已在農(nóng)作物和園藝作物上有了較多成功的應(yīng)用，但SRAP在豆科牧草種質(zhì)資源上的應(yīng)用還非常少，僅在苜蓿（Medicago）［9－15］、大豆（Glycine）［16－18］、三葉草（Trifolium）［19，20］、山羊豆（Galege）［21］、小扁豆（Lens）［22，23］等屬有相關(guān)報(bào)道。本研究主要采用正交設(shè)計(jì)法對SRAP－PCR反應(yīng)條件中主要因子：Mg2＋、dNTP、引物、Taq酶進(jìn)行優(yōu)化分析并確定了模板DNA濃度，旨在篩選出一個(gè)適用于野豌豆屬的穩(wěn)定性及重復(fù)性好，多態(tài)性高的最佳反應(yīng)條件。此外，本研究還對部分SRAP引物組合進(jìn)行了多態(tài)性篩選，希望獲得一些多態(tài)性豐富的SRAP引物組合，為開展SRAP標(biāo)記技術(shù)在山野豌豆種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性等方面的分子生物學(xué)研究提供有利依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用5份山野豌豆材料采自全國3個(gè)不同的地域，優(yōu)化SRAP－PCR體系的DNA模板來自內(nèi)蒙古呼倫貝爾的9號、山西五臺(tái)山的6號及北京百花山的14號DNA；篩選引物所用DNA模板來自山西沁源的11號、北京靈山的5號及內(nèi)蒙古呼倫貝爾的9號DNA。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 PCR反應(yīng)體系設(shè)計(jì)與引物組合 采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對 Mg2＋、dNTP、引物、Taq DNA 聚合酶進(jìn)行4因素3水平篩選（表1）。體系優(yōu)化分別采用3份不同DNA進(jìn)行，每份DNA做2次重復(fù)，取其平均值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。體系總體積為25μL，除表中變化的因素外，每管中還加入2μL 10×PCR buffer和50ng的模板DNA，所用引物組合為Me2＋Em4。

1.2.2 SRAP－PCR擴(kuò)增程序及擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測SRAP－PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；94℃變性1min，37℃退火45s，72℃延伸1min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1min，50℃退火45s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸7min，4℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入5μL 6×loading Buffer緩沖液混勻，取8μL上樣于2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行分離。

1.2.3 模板DNA濃度優(yōu)化 應(yīng)用上述體系最佳組合，引物組合為 Me2＋Em4，DNA模板為5號DNA。將25μL擴(kuò)增體系中模板DNA用量分別設(shè)置6個(gè)梯度處理，即10，20，30，40，50和60ng，對反應(yīng)體系中的模板DNA濃度進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 多態(tài)性SRAP引物組合的篩選 根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果確定的SRAP－PCR最佳反應(yīng)體系，選取Li和Quiros［24］及Riaz等［25］發(fā)表的引物序列，包括7條正向引物和14條反向引物兩兩組合成98個(gè)SRAP引物組合（表2），對3份山野豌豆種源材料進(jìn)行多態(tài)性SRAP引物組合的篩選。

表1 SRAP－PCR［L9（34）］正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal design for SRAP－PCR ［L9（34）］

表2 SRAP引物序列Table 2 Primer sequences used for SRAP analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP－PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的擴(kuò)增結(jié)果分析

山野豌豆SRAP－PCR體系優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。參照何正文等［26］的方法，對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行直觀分析，依據(jù)譜帶的亮度、清晰度以及條帶數(shù)，將9個(gè)處理結(jié)果劃分為9個(gè)評分等級以便統(tǒng)計(jì)分析，內(nèi)蒙古呼倫貝爾的DNA擴(kuò)增結(jié)果得分為1，3，2，5，6，7，9，4和8。山西五臺(tái)山與北京百花山的DNA擴(kuò)增結(jié)果得分分別為1，6，7，8，5，2，9，3和4及6，7，4，3，5，1，9，2和8。3份不同種源的9個(gè)處理結(jié)果的總平均得分為2.67，5.33，4.33，5.33，5.33，3.33，9.00，2.67，6.67。得分最高為組合7帶型清晰，亮度高，且雜帶少，擴(kuò)增效果最好，選為山野豌豆基因組SRAP－PCR的最佳擴(kuò)增反應(yīng)體系。

參照張麗等［27］的方法，對各組分濃度組合的正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析（表3），其中T值代表某水平下某因子參與反應(yīng)所產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶的總和；K代表某因子在某水平參與反應(yīng)所產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶的平均值；R為某因子的極差，即某因子在不同水平下最大平均值與最小平均值之差。R值的大小反映了該因子對試驗(yàn)結(jié)果影響的大小，R值越大，影響越顯著。從R值可看出，在選定的3個(gè)水平范圍內(nèi)，4個(gè)因素對結(jié)果的影響由大到小依次為：引物＞ Mg2＋＞Taq DNA聚合酶＞dNTP。K值反映了影響因素各水平對反應(yīng)體系的影響情況，K值越大，反應(yīng)水平越好。從K值結(jié)果來看，引物以水平3最好，Mg2＋以水平2最好，Taq DNA聚合酶水平3最好，dNTP以水平1最好。綜上，各因素最佳的水平具體為引物2.0μmol／L、Mg2＋2.0mmol／L、Taq DNA 聚合酶1.5U、dNTP 0.2mmol／L，該組合與直觀分析得出的最佳組合7一致，進(jìn)一步確定組合7為最優(yōu)組合。

圖1 SRAP－PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of SRAP－PCR orthogonal design

2.2 模板DNA濃度的確定

應(yīng)用上述最佳反應(yīng)體系，對模板DNA設(shè)置了10，20，30，40，50和60ng 6個(gè)濃度梯度進(jìn)行優(yōu)化。擴(kuò)增結(jié)果表明，在25μL反應(yīng)體系中6種模板DNA用量均能擴(kuò)增出譜帶，且?guī)鸵恢隆５０錎NA濃度不同，譜帶的清晰度存在一定差異。模板DNA用量為10和20ng時(shí)條帶清晰度不佳，30～60ng條帶清晰度稍強(qiáng)且表現(xiàn)一致。考慮到節(jié)省模板用量，最終選定在25μL反應(yīng)體系中加30ng模板DNA為宜。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析Table 3 Statistic result of the orthogonal design

2.3 反應(yīng)體系的驗(yàn)證及多態(tài)性引物組合的篩選

應(yīng)用上述最佳反應(yīng)體系，隨機(jī)組合了98對SRAP引物組合對3份山野豌豆種源進(jìn)行了SRAP擴(kuò)增（圖2）。結(jié)果表明，1）在篩選的98對引物組合中，94對引物組合擴(kuò)增得到清晰穩(wěn)定的譜帶，占總數(shù)的95.9%，表明該反應(yīng)體系具有較好的穩(wěn)定性；在有擴(kuò)增產(chǎn)物的94對引物組合中有20對引物組合擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，占總數(shù)21.3%。2）98對引物共擴(kuò)增出983條帶，其中20對具有多態(tài)性的引物組合擴(kuò)增出的條帶總數(shù)為164條，占總條帶數(shù)的16.7%，具有多態(tài)性的條帶有30條，平均每對引物組合擴(kuò)增出1.5條。3）不同引物組合檢測到的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)目存在差異，變異幅度為1～7。

3 討論與結(jié)論

3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化SRAP－PCR反應(yīng)體系

PCR擴(kuò)增體系主要影響因素包括 Mg2＋、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶以及模板DNA。本研究優(yōu)化出的體系表明引物濃度對擴(kuò)增結(jié)果影響最大，這與黃春瓊等［28］、周良彬等［29］的結(jié)果不一致，這主要是因?yàn)楸狙芯吭谝锾荻仍O(shè)計(jì)時(shí)加入了以前文獻(xiàn)中不常見到的高濃度——2.0μmol／L，僅在昝逢剛等［30］對荔枝（Litchichinensis）和許永華等［31］對人參（Panaxginseng）的研究中分別出現(xiàn)過5 mmol／L和2.0μmol／L的高引物濃度。雖說文獻(xiàn)中常見引物濃度要以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，但本研究結(jié)果表明高濃度的引物濃度不但沒有引起錯(cuò)配反而得到更清晰的條帶，從圖1可看到7道與9道均得到1kb處的條帶，而9道的引物濃度僅為0.2μmol／L，這說明此帶并非非特異性條帶。此后以6號與14號為DNA模板進(jìn)行的重復(fù)試驗(yàn)，也證實(shí)了2.0μmol／L的引物濃度并無非特異性擴(kuò)增條帶，反而條帶清晰這一論斷。其次，影響較大的是Mg2＋濃度。這與王芳［18］、王俊娥［21］、艾鵬飛等［32］、仲叢來等［33］在大豆、山羊豆、小麥（Triticumaestivum）和麻瘋樹（Jatrophacurcas）上的試驗(yàn)結(jié)果一致，這說明在SRAP－PCR反應(yīng)體系中Mg2＋濃度的影響是很大的，在以后的優(yōu)化試驗(yàn)中要重點(diǎn)關(guān)注。再次，影響因子較小的是Taq DNA聚合酶用量和dNTP濃度，其中不同dNTP濃度的擴(kuò)增效果差異很小。在正交試驗(yàn)之后，本研究又對DNA模板用量進(jìn)行了單因素優(yōu)化。雖然DNA模板用量對擴(kuò)增的影響不大［34，35］，但本研究證實(shí)用量過少會(huì)明顯影響條帶的數(shù)量與清晰度，DNA模板用量為10～20ng明顯沒有30～60ng的條帶清晰度高，所以本實(shí)驗(yàn)選擇30ng的DNA模板用量，此結(jié)果與孫佩光等［36］、陳慶榆等［37］的研究結(jié)果一致。

圖2 優(yōu)化的SRAP－PCR反應(yīng)體系在部分引物組合中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results amplified by optimized system using some primer combinations

3.2 SRAP－PCR反應(yīng)優(yōu)化體系的驗(yàn)證

本研究不僅通過98對引物對優(yōu)化出的SRAP－PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了驗(yàn)證，而且在優(yōu)化過程中選用了3種來自北京、山西、內(nèi)蒙古不同地域的模板DNA取得了二次驗(yàn)證，以此保證了優(yōu)化體系的穩(wěn)定性與良好的適用性。與此同時(shí)，本研究亦篩選出20對多態(tài)性良好的引物，對以后山野豌豆的分子生物學(xué)研究打下了良好的基礎(chǔ)。

3.3 結(jié)論

本研究利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對山野豌豆SRAP－PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳反應(yīng)體系為：2μL 10×PCR buffer（不含 Mg2＋）、30ng的模板 DNA、引物2.0μmol／L、Mg2＋2.0mmol／L、Taq DNA 聚合酶1.5U、dNTP 0.2mmol／L，總體積為25μL。

［1］ 陳默君，賈慎修.中國飼用植物［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

［2］ 陳默君.五種野豌豆飼用價(jià)值的初步探討［J］.中國草地學(xué)報(bào)，1986，3：43－46.

［3］ 馬章全，馮忠義.三個(gè)適合農(nóng)牧區(qū)種植的優(yōu)質(zhì)牧草品種［J］.農(nóng)村百事通，2008，（19）：40－41.

［4］ 郜玉田，張雪艷.有發(fā)展前途的新草種——山野豌豆［J］.吉林畜牧獸醫(yī)，1991，（2）：39－40.

［5］ 洪銳民，肖文一.黑龍江省野豌豆屬野生牧草的特征、習(xí)性及其利用［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，1992，（7）：14－15.

［6］ 吳學(xué)敏.一種優(yōu)良野生牧草——山野豌豆［J］.山西水土保持科技，1983，（3）：93.

［7］ 王鶴橋.野生牧草綠肥植物——山野豌豆［J］.中國草原與牧草，1986，3（6）：49.

［8］ 楊巧荷，羅素琴，劉樂樂，等.蒙藥材山野豌豆中的化學(xué)成分定性分析［J］.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，32（5）：475－477.

［9］ 周良彬，盧欣石，王鐵梅，等.雜花苜蓿種質(zhì)SRAP標(biāo)記遺傳多樣性研究［J］.草地學(xué)報(bào)，2010，18（4）：544－549.

［10］ 何慶元，吳萍，張曉紅，等.不同秋眠性苜蓿SRAP體系優(yōu)化及遺傳多樣性分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（2）：201－209.

［11］ 張宇.利用SRAP分子標(biāo)記研究苜蓿雜種優(yōu)勢［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［12］ Ariss J J，Vandemark G J.Assessment of genetic diversity among nondormant and semidormant alfalfa populations using sequence－related amplified polymorphisms［J］.Crop Science，2007，47（6）：2274－2284.

［13］ Vandemark G J，Ariss J J，Bauchan G A，et al.Estimating genetic relationships among historical sources of alfalfa germplasm and selected cultivars with sequence related amplified polymorphisms［J］.Euphytica，2006，152（1）：9－16.

［14］ Castonguay Y，Cloutier J，Bertrand A，et al.SRAP polymorphisms associated with superior freezing tolerance in alfalfa（Medicago sativa spp.sativa）［J］.Theoretical and Applied Genetics，2010，120（8）：1611－1619.

［15］ 關(guān)瀟.野生紫花苜蓿種質(zhì)資源遺傳多樣性研究［D］.北京：北京林業(yè)大學(xué)，2009.

［16］ Baloch F S，Kurt C，Arioglu H.Assaying of diversity among soybean（Glycin max （L.）Merr.）and peanut（Arachis hypogaea L.）genotypes at DNA level［J］.Turkish Journal of Agriculture and Forestry，2010，34（4）：285－301.

［17］ 王賢智.大豆產(chǎn)量相關(guān)性狀的遺傳與穩(wěn)定性分析及QTL定位研究［D］.武漢：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2008.

［18］ 王芳.大豆的SRAP遺傳多樣性及蛋白含量多樣性研究［D］.新鄉(xiāng)：河南師范大學(xué)，2009.

［19］ 張婧源，彭燕，羅燕，等.不同產(chǎn)地白三葉種質(zhì)遺傳多樣性的SRAP分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（5）：130－138.

［20］ 李潤芳.三葉草的細(xì)胞、分子標(biāo)記及多倍體誘導(dǎo)研究［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［21］ 王俊娥.山羊豆屬植物遺傳多樣性研究［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，2008.

［22］ Saha G C，Sarker A，Chen W D，et al.Identification of markers associated with genes for rust resistance in Lens culinaris Medik［J］.Euphytica，2010，175（2）：261－265.

［23］ Saha G C，Sarker A，Chen W D.Inheritance and linkage map positions of genes conferring resistance to stemphylium blight in lentil［J］.Crop Science，2010，50（5）：1831－1839.

［24］ Li G，Quiros C F.Sequence related amplified polymorphism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica［J］.Theoretical and Applied Genetics，2001，103（2－3）：455－461.

［25］ Riaz A，Li G，Quresh Z，et al.Genetic diversity of oil seed Brassica napus inbred lines based on sequence－related amplified polymorphism and its relation to hybrid performance［J］.Plant Breeding，2001，120（5）：411－415.

［26］ 何正文，劉運(yùn)生，陳立華，等.正交設(shè)計(jì)直觀分析法優(yōu)化PCR條件［J］.湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，23（4）：403－404.

［27］ 張麗，周蘭英，肖千文，等.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)在建立杜鵑花RAPD－PCR反應(yīng)體系中的應(yīng)用［J］.北方園藝，2007，（5）：124－126.

［28］ 黃春瓊，周少云，劉國道，等.狗牙根SRAP－PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28（5）：981－989.

［29］ 周良彬，盧欣石，賴?yán)棼?雜花苜蓿SRAP－PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化［J］.草地學(xué)報(bào)，2010，18（3）：345－351.

［30］ 昝逢剛，吳轉(zhuǎn)娣，曾淇，等.荔枝SRAP－PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28（1）：132－136.

［31］ 許永華，王士杰，陳曉林，等.人參SRAP－PCR體系優(yōu)化條件的建立（英文）［J］.農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2010，11（4）：56－58.

［32］ 艾鵬飛，武玉芬，魏景芳.小麥SRAP－PCR體系的正交設(shè)計(jì)優(yōu)化（英文）［J］.農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2011，12（3）：366－368，374.

［33］ 仲叢來，丁貴杰，沈凌麻.麻瘋樹SRAP－PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（4）：19－22.

［34］ Guo D L，Luo Z R.Genetic relationships of some PCNA persimmons（Diospyros kaki Thunb.）from China and Japan revealed by SRAP analysis［J］.Genetic Resources and Crop Evolution，2006，53（8）：1597－1603.

［35］ 郭大龍，羅正榮.部分柿屬植物SRAP－PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化［J］.果樹學(xué)報(bào)，2006，23（1）：138－141.

［36］ 孫佩光，奚如春，鈕世輝，等.油茶SRAP－PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29（6）：1192－1199.

［37］ 陳慶榆，繆成貴，劉曉鋒.棉花高質(zhì)量DNA的提取及SRAP反應(yīng)體系的優(yōu)化［J］.生物學(xué)雜志，2010，27（5）：31－34.