3種生態型野生扁蓿豆種質資源ISSR與SSR遺傳多樣性分析

李鴻雁，李志勇＊，師文貴，蔡麗艷，張靜萍

（1.中國農業科學院草原研究所 農業部沙爾沁牧草資源重點野外科學觀測試驗站，內蒙古 呼和浩特010010；2.內蒙古大學交通學院，內蒙古 呼和浩特010021）

苜蓿屬扁蓿豆植物在內蒙古境內有1個正種、3個變種，即扁蓿豆（Medicago ruthenica）、細葉扁蓿豆（M.ruthenicavar.oblongifolia）、遼西扁蓿豆（M.ruthenica var.liaosiensis）和陰山扁蓿豆（M.ruthenica var.inschanica）［1］。從形態分類上目前有學者在內蒙古發現扁蓿豆新類型，即野生黃花型扁蓿豆［1］。扁蓿豆是苜蓿遺傳改良的重要優異基因來源，具有重要的利用價值。近年來國家牧草種質中期庫收集、保存、鑒定評價了210份野生扁蓿豆種質資源，對篩選出的優良材料從形態學水平、細胞水平和DNA水平進行遺傳多樣性的系統研究。

SSR和ISSR等技術已先后應用于該植物的遺傳多樣性研究［2－6］，基于DNA－PCR的分子標記技術已成為形態學之外的主要分析手段之一。不同分子標記在遺傳多樣性研究中表現出各自的特性。選擇合適的分子標記對能否客觀反映研究對象的狀況具有重要影響。ISSR（inter－simple sequence repeat）是一種利用重復序列加選擇性堿基為引物，對基因組DNA進行擴增的標記［6］，ISSR引物序列長，退火溫度高，特異性和穩定性增強，可檢測到更豐富的遺傳變異。ISSR技術在一些重要的牧草，如無芒雀麥（Bromus inermis）、昆侖錦雞兒（Caragana polourensi）、小花棘豆（Oxytropis glabra）和新麥草（Psathyrostachys juncea）的遺傳多樣性分析方面取得了很大進展［7－10］。Martin和Sanchez－Yelamo［11］研究表明ISSR標記與形態學、生化及其他分子標記存在較高一致性。SSR（simple sequence repeat）是目前應用最為廣泛的分子標記技術之一，具有理想分子標記絕大多數的優良特點，且苜蓿屬SSR引物在種屬間具有一定通用性［12］，近年來，微衛星技術廣泛應用于披堿草（Elymus dahuricus）、鴨茅（Dactylis glomerata）、苜蓿（Medicago sativa）、錦雞兒屬（Caragana）等牧草的遺傳多樣性分析中［13－16］。本研究選取二倍體的黃花型扁蓿豆、細葉扁蓿豆和扁蓿豆為實驗材料，對ISSR和SSR標記在扁蓿豆種質資源研究的可應用性進行探討，并結合種間關系分析比較兩者的標記效率和多樣性檢測能力。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為6份黃花型扁蓿豆、2份細葉扁蓿豆和6份扁蓿豆，均為國家牧草中期庫課題組野外考察收集的材料，原產內蒙古（表1）。于2006年種植在農業部沙爾沁牧草資源重點野外科學觀測試驗站。經田間形態鑒定評價后，分別于2008年和2009年在中國農業科學院國家農作物種質資源保存中心實驗室及國家牧草種質中期庫分子生物學實驗室進行SSR和ISSR標記分析。

表1 14份扁蓿豆種質來源及編號Table 1 The code and origin of the 14accessions of M.ruthenica

1.2 PCR擴增

1.2.1 DNA提取 每份材料隨機選取30個單株的新鮮葉片，用SDS法略加改進提取每個單株葉片基因組DNA。

1.2.2 ISSR擴增和檢測 參考加拿大哥倫比亞大學提供的二核苷酸重復ISSR引物中篩選出多態性豐富的18個引物（表2），對14份材料420個樣品進行PCR擴增。25μL PCR反應體系：模板DNA 0.5ng／μL，10×buffer（含 Mg2＋）2.0mmol／L，TaqDNA聚合酶1.5U，dNTPs 0.6mmol／L，引物0.9μmol／L。PCR擴增：擴增程序為94℃預變性3min，94℃變性30s，50℃復性45s，72℃延伸1.5min，循環35次；72℃延伸10min，4℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，電極緩沖液為1×TAE，電泳時間40min，用DL2000作對照。電泳結束后觀察照相。ISSR引物、dNTPs及TaqDNA聚合酶均購自上海生物工程技術服務有限公司。

1.2.3 SSR擴增和檢測 根據Bernadette等［17］的報道，從89對紫花苜蓿和截形苜蓿SSR引物中篩選多態性豐富、重復性好的18對引物進行扁蓿豆PCR擴增（表2）。PCR反應體系為25μL：模板DNA 3μL，10×Buffer（含 Mg2＋）5.5μL，Taq DNA聚合酶（由北京天根生物公司合成）0.5μL，dNTP 0.75μL，引物（10mmol／L）0.75μL，ddH2O 14.5μL。PCR反應程序為：95℃預變性3min；94℃變性25s，55～66℃（根據不同引物而定）退火30s，72℃延伸30s，35個循環；72℃延伸10min，最后4℃保存。取擴增產物，經6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測（恒功率80W，30min）后，進行銀染、固定、染色和顯影。引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 數據分析

以清晰可辨的擴增條帶在相對遷移位置的有無記數，有擴增帶時，賦值為“1”，無擴增帶時賦值為“0”，生成分子數據矩陣。利用Popgen 3.2統計SSR數據和ISSR數據的遺傳相似系數（GS），Shannon指數、Nei’s指數，利用 NTSYSpc 2.1軟件［18］采用 UPGMA （Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean）法進行聚類分析，繪制親緣關系樹狀聚類圖，用Mantel檢驗進行相關性檢測。

表2 ISSR和SSR的引物序列Table 2 The prime sequences of ISSR and SSR

2 結果與分析

2.1 擴增結果的多態性分析

18個ISSR引物可擴增出清晰而重復性好的條帶，且具多態性，18對紫花苜蓿和截形苜蓿SSR引物可擴增出清晰譜帶，對14份扁蓿豆材料進行PCR擴增。

14份扁蓿豆的ISSR擴增結果見圖1和表3，ISSR擴增出的條帶共143條，條帶的分子量范圍為250～2 000 bp，其中多態性條帶125個，多態性比率平均為87.08%，不同引物擴增出的清晰條帶數為5～11，平均為6.94條。多態性比率變幅為66.67%～100%，差異較大。

14份扁蓿豆的SSR擴增結果見圖1和表3，18對SSR引物共擴增到136個條帶，SSR擴增帶的分子量為70～300bp，其中多態性條帶109個，多態性比率平均為80.09%。不同引物擴增出的清晰條帶數為3～13，平均每個引物擴增出的片段條帶數為6.06條。不同引物擴增的多態性也存在較大的差異，每個引物擴增的多態性片段的百分率介于60.0%～100%。

Shannon指數和Nei’s指數既可以反映條帶的豐富程度，又可以反映均勻程度，而豐富度與均勻度是衡量多樣性的2個重要指標。Nei’s指數估算的18個ISSR引物和18對SSR引物擴增所得位點的種群內和種群間的基因多樣性，不同位點對遺傳多樣性的貢獻不同，SSR的Nei’s指數為0.284，平均Shannon指數0.438，種群內基因多樣性為0.284，遺傳分化系數為0.674，ISSR的Nei’s指數為0.352，平均Shannon指數為0.522，種群內基因多樣性為0.352，遺傳分化系數為1.000（表3）。

2.2 遺傳相似性分析

SSR分析結果表明，利用18對SSR引物產生的109條DNA片段計算了供試材料間的遺傳相似系數（GS）。SSR標記揭示的材料間GS值變化范圍為0.669 7～0.885 3，SSR數據結果：遺傳相似系數（GS）最小的是來自內蒙古呼和浩特市的6號黃花扁蓿豆材料和內蒙古通遼市3號黃花扁蓿豆材料（0.669 7），遺傳距離最遠，遺傳相似程度最低；最大的是來自內蒙古包頭市達茂旗的14號扁蓿豆材料和來自內蒙古赤峰市的12號扁蓿豆材料（0.885 3），遺傳距離最近，遺傳相似程度最高。

ISSR分析結果表明，利用18個ISSR引物產生的125條DNA片段計算了供試材料間的遺傳相似系數（GS）。ISSR標記揭示的材料間GS值變化范圍為0.447 6～0.811 2，ISSR數據結果：遺傳相似系數（GS）最小的是來自內蒙古呼和浩特市武川縣13號的扁蓿豆材料與內蒙古錫林郭勒盟錫林浩特市的9號扁蓿豆材料（0.447 6），遺傳距離最遠，遺傳相似程度最低；最大的是來自內蒙古包頭市達茂旗的14號扁蓿豆材料與內蒙古呼和浩特市的6號黃花扁蓿豆材料（0.811 2）；遺傳距離最近，遺傳相似程度最高。2種標記所得結果基本相似。

圖1 UBC854（A）及 MTIC272（B）擴增產物電泳圖譜Fig.1 Amplification results of UBC854（A）and MTIC272（B）

2.3 聚類分析

2.3.1 ISSR分析 根據以上對遺傳相似性的計算結果，獲得供試材料間的遺傳距離GD（GD＝1－GS），利用UPGMA法進行聚類分析，結果見圖2，閾值在0.646將14份材料分為4大類。第一大類來自內蒙古呼和浩特市武川縣13號的扁蓿豆材料；第二大類包括來自內蒙古赤峰市的12號扁蓿豆材料及來自內蒙古通遼市的11號扁蓿豆材料；第三大類包括來自內蒙古海拉爾市的2號細葉扁蓿豆材料、內蒙古包頭市的4號黃花扁蓿豆材料、內蒙古呼和浩特市的8號黃花扁蓿豆材料、內蒙古呼和浩特市的6號黃花扁蓿豆材料、內蒙古包頭市達茂旗的14號扁蓿豆材料、內蒙古通遼市3號黃花扁蓿豆材料、內蒙古通遼市5號黃花扁蓿豆材料、內蒙古呼和浩特市的7號黃花扁蓿豆材料；第四大類包括內蒙古錫林郭勒盟白音錫勒的1號細葉扁蓿豆、內蒙古錫林郭勒盟錫林浩特市的9號扁蓿豆材料、內蒙古錫林郭勒盟西蘇旗的10號扁蓿豆材料。

表3 ISSR和SSR標記的結果比較Table 3 Comparison of usefulness between ISSR and SSR markers

2.3.2 SSR分析 閾值在0.7將14份材料分為4大類（圖3）。第一大類來自內蒙古錫林郭勒盟白音錫勒的1號細葉扁蓿豆；第二大類包括來自內蒙古海拉爾市的2號細葉扁蓿豆材料、內蒙古呼和浩特市的6號黃花扁蓿豆材料、內蒙古呼和浩特市的8號黃花扁蓿豆材料、內蒙古通遼市5號黃花扁蓿豆材料、通遼市的11號扁蓿豆材料、內蒙古通遼市7號黃花扁蓿豆材料、內蒙古呼和浩特市武川縣13號扁蓿豆材料、內蒙古錫林郭勒盟錫林浩特市的9號扁蓿豆材料、內蒙古赤峰市的12號扁蓿豆材料、內蒙古包頭市達茂旗的14號扁蓿豆材料、內蒙古錫林郭勒盟西蘇旗的10號扁蓿豆材料；第三大類是來自內蒙古通遼市的3號黃花扁蓿豆；第四大類是來自內蒙古包頭市土右旗的黃花扁蓿豆。

圖2 14份扁蓿豆材料的ISSR聚類圖Fig.2 Dendrogram of 14 M.ruthenicagermplasm by ISSR

圖3 14份扁蓿豆材料的SSR聚類圖Fig.3 Dendrogram of 14 M.ruthenicagermplasm by SSR

2.4 2種標記的Mantel檢驗

通過Mantal測驗進行表型性狀歐式遺傳距離矩陣、SSR和ISSR標記的遺傳距離矩陣之間的相關性分析（圖4）。結果表明，二者距離矩陣之間存在顯著相關，相關系數r＝0.019 6，t＝0.121 2證明重要的表型性狀能夠較準確的反映出親緣相近的材料的遺傳變異。

圖4 扁蓿豆材料ISSR分析和SSR分析的關系Fig.4 The data relationship between ISSR and SSR of M.ruthenica

3 討論與結果

分子標記的應用性評價是開展遺傳多樣性分析的基礎工作之一［19］。由于所用標記技術和材料的不同，得出的結論不盡一致。扁蓿豆因其優異的特性具有很大的利用潛力。本研究對收集到的不同生態型的扁蓿豆資源進行了SSR和ISSR遺傳多樣性的分析，2種標記均表現出較高的多態性，表明2種標記在扁蓿豆植物種間分析是有效的。基于SSR和ISSR標記的遺傳相似性系數及UPGMA聚類顯示分析的綜合結果來看，黃花扁蓿豆種質資源遺傳基礎較廣，主要集中在同一個大的類群中，具有一定的同源性，親緣關系較近；ISSR標記具有比SSR標記更高的PPB值，說明前者比后者具有更高的標記效率和有更多的多態性位點，說明SSR標記在親緣物種間具有高度多態性，適于親緣關系較近種群的分析［20］。因此認為ISSR標記在14份扁蓿豆材料間的擴增位點多態性主要由類群間的差異引起，SSR標記可高效的檢測扁蓿豆種質資源中具有較近親緣關系的種群的遺傳多樣性［21］。2種標記的結果相對一致，Mental測驗二者距離矩陣相關系數為r＝0.019 6，t＝0.121 2。SSR 標記和ISSR標記的綜合聚類分析表明，2種標記可以針對不同的類群和不同育種目標對野生扁蓿豆資源進行有目的的改良和利用，從而擴大扁蓿豆遺傳基礎，為扁蓿豆育種積累材料。本研究方法也可為今后扁蓿豆種質資源的創新利用和遺傳多樣性研究提供更為合理準確的參考。

扁蓿豆分布環境的多樣性，導致扁蓿豆不同居群之間以及同一居群不同個體之間形態性狀變異的多樣性。扁蓿豆為苜蓿屬中的一個野生種，是改良和育成新品種的巨大基因庫，利用分子標記開展多基因聚合育種是未來育種的前途所在，借助截形苜蓿等模式牧草的分子標記研究成果，有助于盡快獲得豆科牧草的大量標記和高密度圖譜。

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