NGF及其受體TrkA和p75在發情周期內Wistar大鼠卵巢內的表達

王曉明，白 石，丁 軍

（1.臺州學院醫學院 解剖與組織胚胎學教研室，浙江 臺州 318000；2.吉林大學中日聯誼醫院 放射科，吉林 長春 130033）

NGF及其受體TrkA和p75在發情周期內Wistar大鼠卵巢內的表達

王曉明1，白 石1，丁 軍2＊

（1.臺州學院醫學院 解剖與組織胚胎學教研室，浙江 臺州 318000；2.吉林大學中日聯誼醫院 放射科，吉林 長春 130033）

目的 檢測NGF及其受體TrkA和p75在發情周期內Wistar大鼠卵巢內的表達。方法利用免疫組織化學染色技術檢測NGF及其受體TrkA和p75在卵巢內的細胞定位及蛋白表達情況；利用原位雜交方法檢測在發情周期內大鼠卵巢NGF及其受體TrkA和p75的mRNA表達情況；利用Western blot技術檢測發情周期內大鼠卵巢NGF及其受體TrkA和p75的蛋白表達情況。結果免疫組織化學染色結果顯示發情周期內大鼠卵巢內NGF及其受體的表達，在各級卵泡的卵泡細胞、卵母細胞以及黃體內均有不同水平的表達；同時間點的原位雜交檢測結果與免疫組織化學染色結果相一致；Western blot檢測結果顯示整個發情周期內卵巢內的NGF及其受體TrkA和p75的蛋白表達沒有明顯的波動。結論NGF及其受體TrkA和p75可促進發情周期內Wistar大鼠卵巢卵泡的卵泡細胞及卵母細胞的發育。

卵巢；NGF；TrkA；p75；卵泡

（ChinJLabDiagn，2012，16：0040）

神經生長因子（Nerve growth factor，NGF）是神經營養因子（neurotrophin，NTs）家族中的一員，是中樞神經系統和周圍神經系統內神經細胞存活和分化所必需的靶源性營養因子［1］。NGF常通過激活其特異性受體，酪氨酸激酶受體A（tyrosine kinase A，TrkA）和p75，主要是通過激活TrkA來調控神經細胞的存活和分化。NGF與TrkA結合激活了一系列的胞內信號通路，如ERK和AKT途徑，來促進神經細胞的存活和分化［2］。而p75可與活化的TrkA結合來強化NGF的作用。在沒有TrkA的情況，活化的p75將誘導細胞凋亡［3］。但NGF及其受體，TrkA和p75并非只在神經系統內表達，亦可表達在免疫系統和內分泌系統內［2－5］。已有報道在多種雌性哺乳類動物的卵巢細胞內均有NGF和（或）TrkA，p75表達，如在成年女性［6－8］，雌性大鼠［9，10］、金黃地鼠［11］、牛［12，13］、綿羊［14，15］以及芝山羊［16］卵巢內均有表達。NGF及其受體可能是通過自分泌和旁分泌方式調節卵巢的諸多功能，如性成熟［17］，卵泡發育和 排卵［18，19］。但 NGF 及 其受體TrkA和p75在發情周期內雌性Wistar大鼠卵巢細胞內的周期性變化還未見報道。

1 材料方法

1.1 動物

雌性成年 Wistar大鼠，30只，雄性成年 Wistar大鼠5只，購自杭州師范大學動物中心，1月齡，體重90－110g，按性別分開飼養。

1.2 發情期的判定

大鼠安靜飼養，普通飼料及飲水。通過兩種方法判定發情期：定期檢測晨起（8點）大鼠陰道涂片，監測陰道脫落上皮發育情況。當有較多的有核上皮細胞出現，死亡角化上皮細胞較少，且無白細胞出現時，提示此期大鼠處于發情前期［20，21］；通過發情期行為判定，發情期大鼠，活躍不安，多動；當將雄性大鼠放入雌性大鼠籠后，雄性大鼠有追尾、嗅尿，主動騎跨現象。兩種方法均陽性時，判定為大鼠發情周期的第0天0小時。

1.3 取材

大鼠的發情周期一般為4－5天，較規律。實驗分別于發情周期的5個時間點取材，即8h（排卵期），24h，32h，70h，80h（或0時），每個時間點取材6只。脫頸處死大鼠，取雙側卵巢備用。一側卵巢，4%多聚甲醛固定，常規石蠟切片，片厚3－5 μm，用于免疫組織化學染色及原位雜交染色，另一側卵巢用于Western blot檢測。

1.4 免疫組織化學染色

一抗為兔抗大鼠NGF、兔抗大鼠TrkA和兔抗大鼠p75單克隆抗體，稀釋度為1∶200；SABC免疫組織化學染色試劑盒，均為北京中杉生物試劑有限公司產品。按試劑盒說明書操作。光學顯微鏡觀察染色強度，結果用＋，－號表示（強陽性：＋＋＋，陽性：＋＋，弱陽＋，陰性：－）。實驗設陰性對照，對照切片操作過程同上，但不加特異性一抗，一抗用PBS代替。

1.5 mRNA原位雜交

NGF、TrkA和p75三種因子的mRNA原位雜交檢測試劑盒（POD），均購自武漢博士德生物試劑有限公司。原位雜交程序均按試劑盒說明操作，以大鼠脊髓背根神經節為陽性對照，以PBS代替雜交液作陰性對照。

1.6 Western blot

取卵巢放入玻璃勻漿器中勻漿，取勻超聲粉碎組織細胞，離心12 000rpm 3－5min，吸取上清備用。上清用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定（購自索萊寶生物科技有限公司，上海）蛋白質總量，操作步驟按說明書進行。各時間點均取等量的蛋白質進行SDS-PAGE凝膠電泳，凝膠轉膜，轉移至硝酸纖維素膜。取該膜行免疫印跡染色，檢測NGF及其受體TrkA和p75的蛋白表達水平。抗體為：兔抗大鼠NGF，兔抗大鼠TrkA和兔抗大鼠p75單克隆抗體，稀釋度為1∶1 000。

2 結果

2.1 免疫組織化學染色結果

光學顯微鏡下觀察卵巢內原始卵泡、初級卵泡及有卵泡腔的卵泡（次級和成熟卵泡）的發育及各因子的表達情況。各時間點的卵巢內均有上述3種類型的卵泡。原始卵泡體積較小，在白膜的下方；初級卵泡的體積稍大，無卵泡腔，位置在白膜下較深處，體積大小較均一；有卵泡腔的卵泡，數量較少，位于白膜下方或近白膜處，體積較大，或可見卵丘。其中有卵泡腔的卵泡（次級和成熟卵泡）在8h時，數量最多；前兩種卵泡的數量，在各時間點均未見明顯量的變化。對黃體數量的觀察結果顯示，各時間點內均有黃體，黃體體積較大，近白膜。24h及32h時，黃體數量最多，黃體內細胞密集，細胞體積較大；80 h時雖亦檢測到黃體存在，但黃體內結締組織較多，細胞體積較小。

2.1.1 NGF及其受體TrkA和p75在原始卵泡內的表達 免疫組織化學染色結果顯示：在各時間點的原始卵泡的卵泡壁及卵母細胞內，NGF及其受體TrkA和p75的表達均呈陰性。見圖1。

2.1.2 NGF及其受體TrkA和p75在初級卵泡內的表達 免疫組織化學染色結果顯示：NGF及其受體TrkA和p75在各時間點的初級卵泡的卵母細胞內均呈陰性。各時間點的卵壁內NGF及TrkA和p75均呈陽性表達，其中8h時，染色強度最強，見表1，圖1。

表1 發情周期內卵巢內初級卵泡內NGF及其受體TrkA和p75的表達

2.1.3 NGF及其受體TrkA和p75在有卵泡腔卵泡內的表達 免疫組織化學染色結果顯示：NGF及其受體TrkA和p75在各時間點的有卵泡腔卵泡的卵母細胞及卵泡壁內均呈陽性表達，其中8h和80 h時染色強度較度，見表2，圖1。

表2 發情周期內卵巢內有卵泡腔卵泡內NGF及其受體TrkA和p75的表達

2.1.4 NGF及其受體TrkA和p75在黃體細胞內的表達 免疫組織化學染色結果顯示：各時間點卵巢內的黃體細胞內均有NGF及其受體TrkA和p75陽性表達。其中NGF和TrkA在24h時表達較強，而p75則在80h時表達最強，見表3。

2.2 mRNA原位雜交結果

mRNA原位雜交結果與免疫組織化學染色結果一致，詳見表1、表2和表3，圖2。

表3 發情周期內卵巢內有卵泡腔卵泡內NGF及其受體TrkA和p75的表達

2.3 Western blot檢測結果

于各時間點，NGF及其受體TrkA和p75的蛋白表達量相似。圖3。

圖1 8h時NGF在卵巢內的表達（IHC）。陽性細胞內可見棕黑色顆粒。★為有卵泡腔卵泡，▲為初級卵泡，↑為原始卵泡。20×

圖2 8h時TrkA在卵巢內的表達（原位雜交）。陽性細胞內可見棕黃色顆粒，▲為初級卵泡，↑為原始卵泡。40×

圖3 發情周期內NGF，TrkA和p75蛋白在Wistar大鼠卵巢內的表達

3 討論

大鼠的性周期一般為4－5天，性周期較規律，可根據陰道涂片檢測脫落上皮的發育情況將發情周期分為5期［20］，即發情前期，發情期，發情后期I，發情后期II，及發情間期。一般發情前期可持續9－18小時，發情期可持續6－12小時，發情后期I期可持續18－24小時，發情后期II期，可持續12－24小時，而發情間期一般可持續36－42小時。與卵巢卵泡的發育期存在大致的對應關系為，發情前期為排卵前期，即成熟卵泡形成期；發情期為排卵期，此期，即將排卵；其它三期為生長卵泡發育期。為保證我們選的取材時間點均在發情周期的每個時段內，每一時間點均選在每一期的中期。

卵巢屬于女性的內生殖器官，亦屬于內分泌腺，可分泌FSH、LH等多種激素，激素的分泌與顆粒細胞，即卵泡壁細胞，以及黃體等結構有關［22］。黃體在人類可分月經黃體和妊娠黃體，月經黃體的存在取決于排出的卵是否受精［22］。在大鼠，非靈長類動物，每孕多胎，每次排卵多個，且沒有月經的形成，故黃體退化較慢，長時間內黃體一直存在［20］。人類的卵泡出生時有70－200萬個，青春期時，僅剩4萬個左右；女性一生只排400多個，其余均于不同階段退化［22］，大鼠卵巢內亦有類似的退化現象，退化是一種凋亡過程［22］，我們的結果顯示各時間點原始、初級及有卵泡腔卵泡的卵泡壁內卵母細胞內p75均有表達，但量有不同，時多時少。有文獻報道當有活化的TrkA存在時，p75可與之結合，可強化NGF的作用；當TrkA不存在時，p75可誘導細胞凋亡［2］。我們的實驗結果，提示閉鎖卵泡的形成可能與p75表達有關。閉鎖卵泡可以發生在卵泡各個階段。同時有相關文獻報道NGF可促進性腺的發育［2］。我們的實驗結果顯示在不同期的卵泡的卵泡壁及卵母細胞內NGF均有一定的表達。眾所周知NGF是通過TrkA受體完成調控作用的［2］。我們的實驗結果顯示對TrkA的檢測結果與NGF的檢測結果一致。但Western blot結果顯示，NGF及其受體在卵巢內表達的總蛋白水平在整個周期內并沒有明顯的波動，這可能與激素的分泌有關。我們在實驗中同時觀察到非卵泡細胞，如卵泡膜細胞和間質細胞，NGF及其受體于各時間亦有表達，且表達趨勢呈與NGF等在卵泡上的表達趨勢相反的現象，數據未統計。

總之，我們觀察了發情周期內Wistar大鼠卵巢內NGF及其受體的細胞定位及表達水平，結果顯示NGF及其受體均有不同程度的表達，提示NGF及其受體可能對卵泡的發育有促進作用。

［1］Leibrock J，Lottspeich F，Hohn A，et al.Molecular cloning and expression of brain－derived neurotrophic factor［J］.Nature，1989，341（6238）：149.

［2］Huang EJ，Reichardt LF.Trk receptors：roles in neuronal signal transduction［J］.Annu Rev Biochem，2003，72：609.

［3］Vega JA，García-Suárez O，Hannestad J，et al.Neurotrophins and the immune system［J］.J Anat，2003，203（1）：1.

［4］Ojeda SR，Romero C，Tapia V，et al.Neurotrophic and cell-cell dependent control of early follicular development［J］.Mol Cell Endocrinol，2000，163（1－2）：67.

［5］Tessarollo L.Pleiotropic functions of neurotrophins in development［J］.Cytokine Growth Factor Res，1998，9（2）：125.

［6］Anderson RA，Robinson LL，Brooks J，et al.Neurotropins and their receptors are expressed in the human fetal ovary［J］.J Clin Endocrinol Metab，2002，87（2）：890.

［7］Salas C，Julio-Pieper M，et al.Nerve growth factor-dependent activation of trkA receptors in the human ovary results in synthesis of follicle-stimulating hormone receptors and estrogen secretion［J］.J Clin Endocrinol Metab，2006，91（6）：2396.

［8］Spears N，Molinek MD，Robinson LL，et al.The role of neurotrophin receptors in female germ-cell survival in mouse and human［J］.Development，2003，130（22）：5481.

［9］Dissen GA，Hirshfield AN，Malamed S，et al.Expression of neurotrophins and their receptors in the mammalian ovary is developmentally regulated：changes at the time of folliculogenesis［J］.Endocrinology，1995，136（10）：4681.

［10］Romero C，Paredes A，Dissen GA，et al.Nerve growth factor induces the expression of functional FSH receptors in newly formed follicles of the rat ovary［J］.Endocrinology，2002，143（4）：1485.

［11］Shi Z，Jin W，Watanabe G，et al.Expression of nerve growth factor（NGF），and its receptors trkA and p75in ovaries of the cyclic golden hamster（Mesocricetus auratus）and the regulation of their production by luteinizing hormone［J］.J Reprod Dev，2004，50（6）：605.

［12］Dissen GA，Parrott JA，Skinner MK，et al.Direct effects of nerve growth factor on thecal cells from antral ovarian follicles［J］.Endocrinology，2000，141（12）：4736.

［13］Levanti MB，GermanàA，Abbate F，et al.TrkA and p75NTR in the ovary of adult cow and pig［J］.J Anat，2005，207（1）：93.

［14］Barboni B，Mattioli M，Gioia L，et al.Preovulatory rise of NGF in ovine follicular fluid：possible involvement in the control of oocyte maturation［J］.Microsc Res Tech，2002，59（6）：516.

［15］Mattioli M，Barboni B，Gioia L，et al.Nerve growth factor production in sheep antral follicles［J］.Domest Anim Endocrinol，1999，17（4）：361.

［16］Ren L，Medan MS，Weng Q，et al.Immunolocalization of nerve growth factor（NGF）and its receptors（TrkA and p75LNGFR）in the reproductive organs of Shiba goats［J］.J Reprod Dev，2005，51（3）：399.

［17］Lara HE，McDonald JK，Ojeda SR.Involvement of nerve growth factor in female sexual development［J］.Endocrinology，1990，126（1）：364.

［18］Dissen GA，Hill DF，Costa ME，et al.A role for trkA nerve growth factor receptors in mammalian ovulation［J］.Endocrinology，1996，137（1）：198.

［19］Dissen GA，Romero C，Hirshfield AN，et al.Nerve growth factor is required for early follicular development in the mammalian ovary［J］.Endocrinology，2001，142（5）：2078.

［20］魏 泓.醫學實驗動物學［M］.成都：四川科學技術出版社，1998：164－165.

［21］王月鵬，趙行宇，張慧鋒.成年大鼠性周期陰道細胞變化探究［J］.中國科技信息，2007，17：192.

［22］石玉秀.組織學與胚胎學［M］.北京：高等教育出版社，2007：205－215.

The expression of NGF and its receptors TrkA and p75in ovary during the estrous cycle

WANGXiao-ming，BAIShi，DINGJun.（DepartmentofAnatomyandEmbryologyofTaizhouUniversity，Taizhou318000，China）

ObjectiveTo detect the expression of NGF and its receptors TrkA and p75in Wistar rats ovary during the estrous cycle.MethodsImmunohistochemistry for the localization and protein expression of NGF and its receptors TrkA and p75in ovarian cells；In situ hybridization for the mRNA expression of NGF and its receptors TrkA and p75 in the ovary during the estrous；Western blotting for the protein amount of NGF and its receptor TrkA and p75in the ovary during the estrous.ResultsThe results of immunohisochemistry showed there were different expression levels of NGF and its receptor TrkA and p75in the ovary，included the follicles，oocytes and corpus luteum in the ovary during the estrous；the results of in situ hybridization during the same period showed the same mRNA levels change of them as immunohistochemsitry results showed；but the results of Western blot during the same period showed there were not obviously change of the protein amount change of NGF and its receptor TrkA and p75.ConclusionNGF and its receptors TrkA and p75can promote the development of follicle cells and oocytes in the Wistar rat’s ovary during the estrous cycle.

ovary；NGF；TrkA；p75；follicle

R329.1

A

1007－4287（2012）01－0040－04

＊通訊作者

2010－09－23）