抗心磷脂抗體IgG時間分辨熒光免疫分析法的建立

胡志剛，劉 潔，葉 燕，陳國千，鄒耀紅，俞 蕾

（南京醫(yī)科大學附屬無錫市人民醫(yī)院1.檢驗科；2.呼吸科；3.風濕科，江蘇 無錫 214023）

抗心磷脂抗體（anticardiolipin antibody，ACA）是一種以血小板和內(nèi)皮細胞膜上帶負電荷的心磷脂作為靶抗原的自身抗體。ACA常見于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病，與血栓形成、自然流產(chǎn)或?qū)m內(nèi)死胎關(guān)系密切［1－3］。在自身免疫反應過程中，ACA的變化以IgG為主［4］。目前對ACA的檢測主要方法為酶聯(lián)免疫分析法［3，5］。酶聯(lián)免疫分析為大分子有活性的酶標記，在靈敏度、線性范圍和穩(wěn)定性方面有所欠缺，此外，測量精度也不夠高［6，7］。建立靈敏、穩(wěn)定、線性范圍寬、便捷的 ACA檢測方法有重要臨床意義。本試驗采用ACA抗原（心磷脂＋β2糖蛋白I）和Eu3＋標記的鼠抗人IgG抗體，建立穩(wěn)定的高靈敏度的時間分辨熒光免疫（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）法檢測人血清中的心磷脂抗體，報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑全自動TRFlA檢測儀AutoDELFIA-1235為芬蘭Perken公司產(chǎn)品；96孔微孔板、人重組β2糖蛋白I、心磷脂、ACA酶聯(lián)免疫試劑盒、ACA-IgG抗體標準品為德國AESKU公司產(chǎn)品；鼠抗人IgG二抗由中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)科學研究所提供；Eu3＋標試劑和Eu3＋發(fā)光增強液購自EG＆G-Wallac公司；N2-［p－異氰酸－芐基］－二乙烯三胺四乙酸（DTTA）為Sigma公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白（BSA）購自衛(wèi)生部上海生物制品研究所；Sephadex-G25為美國Pharmacia公司產(chǎn)品；濃縮洗滌液、增強液及反應緩沖液由江蘇省原子醫(yī)學研究所提供。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 固相抗原制備 將ACA抗原用50mmol／L Na2CO3－NaHCO3pH 9.6緩沖稀釋制成包被液，96孔微孔板各孔加100μl，4℃包被過夜。棄去包被液，沖洗3次，每孔加250μl含3g／L BSA的上述緩沖液封閉，室溫放置2h。棄去封閉液，拍干后真空抽干，板條密封后置－20℃冷凍保存。

1.3 Eu3＋標記抗體的制備Eu3＋－鼠抗人IgG抗體參照Eu3＋標記盒說明書操作。取鼠抗人IgG抗體l ml，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件，洗脫液為含0.155mol／L NaCl的 50mmol／L Na2CO3－NaHCO3pH 8.5緩沖液。收集蛋白峰，濃縮至2g／L。取500μl加入含0.2mg的 Eu3＋-N2-［p－異氰酸-芐基］-二乙烯三胺四乙酸（Eu3＋-DTTA）凍干粉的小瓶中，25℃磁力攪拌反應20h。反應液經(jīng)用80 mmol／L tris-HCl pH 7.8緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱（1×40cm）層析，全自動TRFIA檢測儀檢測，收集蛋白峰，稀釋后分裝凍干保存。

1.4 ACA－IgG抗體的測定采用二抗間接法，加用稀釋液稀釋的血清100μl到板條中，25℃反應30min后，洗滌4次，然后加分析緩沖液稀釋的Eu3＋-鼠抗人IgG抗體100μl，25℃振蕩反應30min后，洗滌6次，再加200μl增強液振蕩5min，在AutoDELFIA-1235儀上檢測熒光信號。最后從標準曲線計算樣品中的ACA-IgG抗體的含量（軟件程序機器自帶）。

1.5 試劑盒的評價（1）對試劑盒進行劑量－反應曲線的線性進行評價；（2）精密度評價：選低、中、高3份血清樣品，同時采用TRFIA法進行批內(nèi)（n＝20）和批間（n＝8）精密度檢測，計算其CV%值；（3）靈敏度：測定20孔零點標準品，x—±2s為其最小測定值，即其靈敏度；（4）特異度：收集50例健康獻血者，檢測這些患者血清中的ACA-IgG抗體，計算臨床特異度；（5）相關(guān)性實驗：25例陽性血清樣品，分別用TRFIA和ELISA 2種方法進行檢測，計算其相關(guān)系數(shù)；（6）穩(wěn)定性：將試劑盒置于37℃水浴箱7天，再與正常保存的試劑盒做對比。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。2種方法檢測結(jié)果的一致性檢驗采用相關(guān)性分析，并計算相關(guān)系數(shù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Eu3＋標二抗的理化和免疫學鑒定Eu3＋標記鼠抗人抗體經(jīng)sephadex G-25層析，收集第1洗脫峰，見圖1。

2.2 線性范圍將一強陽性標本從1∶12.5倍稀釋至1∶204800，線性稀釋濃度曲線見圖2，曲線呈良好線性在稀釋濃度1∶50－1∶51200的范圍內(nèi)。

2.3 ACA-IgG抗體-TRFIA的考核數(shù)據(jù)處理得到ACA-IgG-TRFIA的標準曲線，如圖3所示。x軸代表熒光強度，y軸代表ACA-IgG抗體的濃度，結(jié)果顯示劑量－反應曲線呈良好線性相關(guān)。

圖1 TRFIA檢測sephadex G-25洗脫峰 圖2 TRFIA法測ACA可測量范圍 圖3 ACA-IgG抗體-TRFIA的標準曲線

2.4 精密度評價將低、中、高3份血清樣品，同時采用TRFIA法檢測，進行批內(nèi)和批間精密度測試。

表1 批內(nèi)精密度測試（n＝20）

表2 批間精密度測試（n＝8）

2.5 靈敏度測定20孔零點標準品，x—±2s為其最小測定值，為0.1GPL U／ml。

2.6 相關(guān)性實驗25例陽性血清樣品，分別用TRFIA和ELISA 2種方法所測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.987，呈高度相關(guān)。

2.7 臨床特異度采用自制TRFIA試劑檢測50例健康獻血者血清中的ACA-IgG抗體，陰性49份，陽性1份，特異度為98%。

2.8 穩(wěn)定性試驗將試劑盒置于37℃水浴箱7天，再與正常保存的試劑盒做對比，結(jié)合率僅下降15.8%，其余指標沒有明顯變化，說明試劑盒穩(wěn)定性良好，在4℃條件下可保存1年。此外，對于ELISA方法，加入終止液后，隨著時間的延長，檢測的準確度下降；而對于TRFIA，加入增強液后，板條放至次日而基本不影響熒光結(jié)果的檢測，由此可見，TRFIA法更穩(wěn)定。

3 討論

早期研究人員即發(fā)現(xiàn)，ACA ELISA采用牛血清作為封閉液和稀釋液時，可以更好地診斷抗磷脂綜合征（A ntiphoaphulipids vndrome，APS），進一步研究發(fā)現(xiàn)，APS患者的ACA與心磷脂的結(jié)合需要血清中一種磷脂結(jié)合蛋白－β2糖蛋白I（β2GPI）參與，而牛血清中恰恰含有β2GPI，自身免疫性疾病（如SLE）ACA與包被心磷脂的結(jié)合可以因β2GPI的存在而增強，即稱其為β2GPI依賴性ACA；相反，梅毒患者血清中的ACA與心磷脂的結(jié)合卻可被β2GPI抑制，因此又將這些ACA稱為非β2GPI依賴性 ACA［5，8，9］。 目 前 認 為 APS 與 β2GPI依 賴性ACA有關(guān)，而與非β2GP1依賴性ACA無關(guān)。本研究建立的是β2GPI依賴性ACA TRFIA法。

當前，檢測ACA多采用ELISA法，ELISA方法存在靈敏度低、線性范圍窄、酶標記物不穩(wěn)定等諸多問題。時間分辨熒光免疫分析技術(shù)是近幾年快速發(fā)展起來的新技術(shù)，具有零本底、靈敏度高、重復性好、特異性強、線性范圍寬等特點。TRFIA技術(shù)標記離子的熒光激發(fā)光波長范圍較寬，發(fā)射光譜峰范圍窄，是類線光譜，有利于降低本底熒光強度，提高分辨率，檢測精度可達10－18mol／L。激發(fā)光和發(fā)射光之間有一個較大的Stokes位移，有利于排除非特異熒光的干擾，增強測量的特異性。標記離子螯合物產(chǎn)生的熒光強度高，壽命長，有利于消除樣品及環(huán)境中熒光物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。每一秒鐘檢測樣品1000次，結(jié)果取平均值，有利于提高檢測的準確性［10－12］。TRFIA 被 廣 泛 用 于 C 反 應 蛋 白［13］、水痘－帶狀皰疹病毒-IgG抗體［14］、乙型肝炎病毒前S1抗原［12］、抗環(huán)瓜氨酸肽段抗體［6］、人巨細胞病毒IgM 抗體［7］等的檢測。

在以往ELISA法檢測ACA過程中，我們發(fā)現(xiàn)有大量ACA弱陽性及臨界值的存在，加上準確性和重復性欠佳，給臨床診斷這部分患者的自身免疫性狀況帶來了影響。而本試劑盒靈敏度達到0.1 GPL U／ml，遠低于正常參考上限10GPL U／ml，且高、中低三個濃度批內(nèi)、批間CV均小于10%，從而能夠很好地解決這一問題。50例健康獻血員血清樣本進行ACA的檢測，特異性98%，說明本系統(tǒng)不僅靈敏度高，特異性也好。

與國外成熟ELISA試劑相比，2種方法所測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.987，呈高度相關(guān)，一致性較高，證明其結(jié)果可靠。線性范圍試驗顯示，將一強陽性標本從1∶12.5倍稀釋至1∶204800熒光計數(shù)值從高到低均有明顯變化，曲線呈良好線性在稀釋濃度1∶50－1∶51200的范圍內(nèi)，具有很寬的量程。將試劑盒置于37℃水浴箱7天，再與正常保存的試劑盒做對比，結(jié)合率僅下降15.8%，其余指標沒有明顯變化，說明試劑盒穩(wěn)定性良好，在4℃條件下可保存1年。

時間分辨熒光免疫分析儀在國內(nèi)已較普遍使用，儀器全自動操作，誤差減少，操作流程短。銪標記鼠抗人IgG抗體的制備經(jīng)專業(yè)人員培訓后可成功標記，儲存時間長、無放射性污染。目前，進口或國產(chǎn)的ACA抗體商品試劑盒在2500圓左右，每份標本的檢測成本約30圓，而本實驗室建立的TRFIA法檢測ACA抗體的成本在10圓左右，有價格優(yōu)勢。基于以上幾個方面，TRFIA法定量檢測ACA抗體的方法有望普遍應用。

總之，利用TRFIA方法定量檢測ACA抗體，靈敏度、特異度、精密度高，檢測范圍寬，試劑盒穩(wěn)定可靠，對于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病患者的病情，監(jiān)測治療效果及預后具有重要意義。

［1］周建萍，柒銘銘.抗心磷脂抗體與復發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系分析［J］.中國醫(yī)師雜志，2008，10（6）：829.

［2］朱曉浚，劉次偉.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血小板減少與血小板相關(guān)抗體和心磷脂抗體的相關(guān)性研究［J］.臨床皮膚科雜志，2007，36（4）：224.

［3］劉宗花，王謝桐，王燕蕓.肝素對復發(fā)性流產(chǎn)患者抗心磷脂抗體陽性血清抑制人絨毛膜癌細胞增殖的調(diào)節(jié)作用［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2007，42（11）：749.

［4］Yamamoto T，Mimura O，Kawasaki T，et al.Retinal vein occlusion followed by ischemic optic neuropathy with anticardiolipin IgG antibody：a case report［J］.Nippon Ganka Gakkai Zasshi，2009，113（10）：972.

［5］余自強，王兆鉞.抗磷脂綜合征發(fā)病機制與診療進展［J］.中華血液學雜志，2007，28（9）：643.

［6］李 梅，陳國千，葉 燕，等.時間分辨熒光免疫分析法測定抗環(huán)瓜氨酸肽抗體方法學的建立［J］.中華風濕病學雜志，2010，14（12）：815.

［7］潘宇紅，周 彬，黃 飚，等.巨細胞病毒IgM抗體時間分辨熒光免疫分析法的建立［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2009，32（9）：1050.

［8］Pierangeli SS，Gharavi AE，Harris EN.Testing for antiphospholipid antibodies：problems and solutions［J］.Clin Obstet Gynecol，2001，44（1）：48.

［9］謝 飛，朱忠勇.抗心磷脂抗體檢測和抗磷脂抗體綜合征診斷［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2003，26（4）：254.

［10］Barnhill HN，Claudel-Gillet S，Ziessel R，etal.Prototype protein assembly as scaffold for time-resolved fluoroimmuno assays［J］.J Am Chem Soc，2007，129（25）：7799.

［11］Huang B，Xiao H，Zhang X，et al.Ultrasensitive detection of pepsinogen I and pepsinogen II by a time-resolved fluoroimmunoassay and its preliminary clinical applications［J］.Anal Chim Acta，2006，571（1）：74.

［12］胡志剛，劉 潔，陳國千，等.時間分辨免疫熒光定量檢測乙型肝炎病毒前S1抗原的研究［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2006，29（5）：407.

［13］Parra MD，Tuomola M，Cabezas-Herrera J，et al.Analytical and clinical validation of a time-resolved immunofluorometric assay（TR-IFMA）for canine C-reactive protein in serum［J］.Vet Res Commun，2006，30（2）：113.

［14］Maple PA，Gray J，Breuer J，et al.Performance of a time-resolved fluorescence immunoassay for measuring varicella-zoster virus immunoglobulin G levels in adults and comparison with commercial enzyme immunoassays and Merck glycoprotein enzyme immunoassay［J］.Clin Vaccine Immunol，2006，13（2）：214.