Stat3-siRNA表達質粒在AFP陽性腫瘤基因治療中的應用

鹿理友 于傳亭 辛志玲

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，具有發展迅速，侵襲性強，惡性程度高，預后差等特點[1]。雖然手術技術的提高，治療有了很大的提高，但發現時往往已至晚期，手術效果不理想。基因表達水平的改變是細胞癌變的一個重要因素。近幾年發現和發展起來的RNA干擾技術，是一種新興基因阻斷技術，同源性mRNA的降解通過內外源性雙鏈RNA觸發，從而使該基因表達沉默。人體正常組織及細胞中有STATs少許表達，正常的生理功能得以維持。但持續性的激活在腫瘤組織及細胞中卻表現出來[2]，被認為是潛在的腫瘤抑制因子。其中以sTAT3尤為活躍，現多認為其可促進腫瘤細胞的凋亡[3]。本研究觀察stat3-siRNA表達質粒在治療AFP陽性腫瘤基因中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI 1640培養基購自Invitro-gen公司;無內毒素質粒提取試劑盒購自Qiagen公司;轉染試劑購自大連寶生物公司;電脈沖儀為德國ECM 630;電擊杯購自Bio-Rad生物公司;細胞總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司);反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-p01ymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒購自TAKARA公司;人肝癌細胞株HepG2為本室保存。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 常規方法接種于1640新鮮培養基復蘇的肝癌細胞株 HepG2，于37℃，5%的 CO2培養箱中培養，含10%小牛血清，含均100 U/ml雙抗青霉素、鏈霉素，G418濃度為400ug/ml，傳代培養用0.25%的胰蛋白酶消化，觀察是否為細胞對數生長期，備實驗用。

1.2.2 質粒DNA的擴增與抽提 由上海生物工程技術有限公司合成的長度為350 bpPCR產物，引物序列如下:βactin sense: 5'GCACCACACCTTCTACAATG 3'; antisense:5'GTGGTGAAGCTGTAGC3'。根據美國國立衛生圖書館基因庫中人STAT 3 mRNA序列(NM 31500)合成其引物序列如下:mstAT 3 sense:5'CAGccTcTCTGCAGAATTCAA3';antisense:5'AGCCCATGTGATCTGACACC 3'，取 100 μl感受態細胞，待轉化的質粒DNA50ng加入，輕輕混勻后30 min冰浴，熱休克42℃90 s后，立刻2 min冰浴，LB 培養基900 μl加入，搖床振蕩，45 min培養。離心5 min以4℃4000 r/min，大部分上清棄去，僅200 μl培養基留下，菌體輕輕莆懸，在50 μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂糖平板上將其涂布，37℃培養過夜，接種陽性菌落于4ml LB培養基中，37℃振蕩過夜。質粒抽提采用美國Qiagen公司小提質粒試劑盒，嚴格依照說明書步驟提取。

1.2.3 RNA的提取 按試劑說明書完成RT-PCR收獲的細胞，取總RNA10 μg逆轉錄為cDNA以紫外分光光度計法定量后進行，PCR條件:94℃，5 min;94℃，30 s;56℃，30 s;72℃，45 s;72℃，7 min，30循環，25 μL體系，PCR 產物以20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，以β-actin為內參，EB染色，圖像分析應用天能Gis凝膠成像系統，以光密度/面積表示PCR產物量，最終結果以STAT3產物量/b-actin產物量的比值，3次實驗重復，引物序列:引物均由上海生工公司合成，B-actin:Sense5'-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3'， Antisence5'-ATGCTATCACCTCCCCTGTG-3';STAT3:Sense5'-TTGCCAGTTGTGGTGATC-3'，Antisence 5'-AGACCCAGAAGGAGCCGC-3'。

1.2.4 Western blot方法檢測 收集空白組、陰性對照組、siRNA組細胞。離心制備的單細胞懸液，上清液棄去，PBS沖洗，50 μl預冷的細胞裂解液加入，30 min冰浴中裂解，離心20 min已4℃、12000r/min，取上清，-70℃保存待測。測定蛋白含量應用Bradford比色法。樣品電轉移到PVDF膜上，在SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后。置PVDF膜于5%脫脂奶粉溶液中。4℃封閉過夜。加入兔抗人，濃度為1∶500～1∶1000，1.5～2 h抗孵育。TBST洗膜后加入羊抗兔二抗1∶5000孵育。lh孵育，Lurriglo Keageut試劑A、B液洗膜后加入，反應15～30 min。X光片暴光，拍照。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 培養緩沖液中加入轉染后的肝癌細胞，按Immuno-tech公司的說明書進行，用冰PBS液洗2次1×106個/ml細胞，細胞濃度調整為1×106個/ml，于490 μL細胞懸液中加入5 μl Annexin V液(1∶10稀釋)和5ul碘化丙錠(250μg/ml，冰浴放置10min，轉染48h后的細胞1×106個分別收集，離心，細胞用冷PBS懸浮，離心10min以1000 r/min，清洗2遍，棄上清，用1ml注射器將細胞快速推入700ml/L冷乙醇中，4℃固定12 h以上，PBS洗2次，細胞密度調整為1×109/L，用RNase消化后，1.5ml PI50 mg/L加入對DNA進行染色，混勻后單參數分析上流式細胞儀FCM做，各期細胞所占比例根據實驗數據用累積曲線分割法計算，實驗共重復3次，用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行數據處理，計量數據均以均數±標準差(±s)表示。多組均數間的顯著性檢驗用方差分析，兩組均數間的比較用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 stat3 mRNA的表達量比較 經比較，stat3相對量在空白組和陰性對照組無明顯差異，siRNA組的stat3相對量比空白組和陰性對照組明顯減少(P＜0.01)，見表1。

表1 stat3 mRNA的表達量比較

2.2 凋亡率與G1期阻滯率的比較 流式細胞儀結果顯示，轉染stat3-siRNA的細胞與陰性對照組、空白對照組比較在G1期出現明顯阻滯，在 G1期出現的阻滯為(78.17±21.73)%，凋亡率達(21.39±9.47)%，與空白組和陰性對照組比較有明顯差異(P＜0.01)，見表2。

表2 凋亡率與G1期阻滯率的比較

3 討論

世界范圍內原發性肝癌是發病率最高的惡性腫瘤之一，新患此病的患者每年約有100萬以上，肝癌發患者數中國居世界首位，每年死于肝癌約23萬人，占全球肝癌患者死亡數的53%，列惡性腫瘤病死率第2位，雖有進展的綜合性治療手段，但令人滿意的療效仍不能取得[4]。到目前尚未清楚肝癌的確切發病機制，但可以肯定其形成是一個多因素、多階段、多步驟、多系統、多基因參與的復雜過程，一些信號轉導通路的異常可能涉及到，進而異常的激活一系列原癌基因以及失活導致的抑癌基因突變。

近年來興起的RNAi技術，分子生物治療中為異常表達stat3腫瘤開辟了新的途徑，與傳統的基因治療方法相比RNAi具有兩大明顯優勢，高特異性和高抑制率，與之序列同源的mRNA能夠被siRNA非常特異地誘導降解，而無關基因不受影響;且其表達抑制基因的效率極高，甚至基因表達可完全阻斷，效果接近基因敲除技術。siRNA是21-23bp小片段雙鏈RNA，可以和靶基因mRNA序列特異性互補結合，誘導其降解，RNA干擾效應產生強大[5]。近年siRNA成功轉入活體內的進展，使得siRNA藥物被人們越來越期待能成為精力充沛的“魔術子彈”，應用于病毒感染、寄生蟲感染、人類腫瘤等的治療[6]。siRNA可以特異性地作用于信號轉導通路以及肝癌的相關基因，可望提供標記物和治療靶點為肝癌的診斷和治療[7]。與蛋白相比，在細胞能耗方面非編碼RNA作為調控分子存在優勢，因為其不需要翻譯，能量消耗更少，而且比蛋白更容易降解[8]。

Stat3是一類脫氧核糖核酸結合蛋白，有少量表達在細胞漿內，其在細胞核內無表達，是轉錄激活因子家族與信號轉導的重要成員之一。Stat3信號傳導通路接受多種非受體酪氨酸激酶、G蛋白、細胞因子、生長因子等分子刺激，通過借助細胞內的一類具有激酶結構的連接蛋白JAKs磷酸化而被激活從而完成信息轉導。設想癌細胞內stat3基因的表達如能設法阻斷，癌細胞增殖能力定會大大減弱，同時減弱凋亡抑制[9]。Gao等[10]設計人喉部鱗狀細胞癌Hep2細胞轉染兩對STAT3-siRNA，研究結果顯示在未經處理的Hep2細胞和空質粒對照的Hep2細胞中STAT3被表達，而STAT3的表達在siRNA-sTAT3轉染的細胞中明顯減少，且表現為時間和劑量依賴性。

RNAi技術可以使特定基因的表達在mRNA水平抑制。而一種簡單有效的RNAi實現方法是通過化學合成、細胞內表達siRNA。本研究中，我們成功地合成了siRNA轉染肝癌HepG2細胞后。實現了有效抑制STAT3的基因表達，與空白組和陰性對照組均有明顯差異(P＜0.01)。充分顯示了該技術抑制基因表達特異、高效、簡便快捷的優點。應用Western blot證實stat3在人肝癌細胞的過度表達由于siRNA而明顯抑制，隨著stat3表達抑制，癌細胞出現凋亡，本研究顯示siRNA組的凋亡率明顯比空白組和陰性對照組增高(P＜0.01)。我們認為，以sTAT3為靶點的siRNA技術有望成為肝癌基因治療的新途徑。

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