IVF-ET周期中1PN及0PN胚胎的非整倍體研究進展

韋 多，張翠蓮，宋小兵，謝娟珂，劉 琦，呼 琳，殷寶莉

(河南省人民醫院生殖醫學中心 河南鄭州 450003)

在人類體外授精-胚胎移植(in vitro fertilizationembryo transfer，IVF-ET)技術中，國內外許多學者在授精18～20 h內通過光學顯微鏡對胚胎原核數目進行觀察及評分［1］，以觀察到明確的2PN(pronucleus)及2PB(polar body)作為正常受精的判斷標準［2］，從中選擇優質的胚胎進行移植。1PN、0PN通常被視為異常受精胚胎［3］，與多原核及發育停滯的2PN胚胎一同作為廢棄胚胎被銷毀，目前此方法被廣大中心所采用。但是出現這種現象的原因一部分是由于錯過了最佳的觀察時機，從而可能造成胚胎資源的浪費。從提高IVF-ET成功率，降低治療周期取消率，減少染色體病患兒出生的角度出發，如果要將這部分胚胎加以利用，研究其染色體非整倍體性，對判斷其移植價值有著重要意義。

1 對1PN及0PN胚胎利用的必要性

染色體非整倍體改變在人類IVF-ET周期中十分常見，它可導致自發流產、死產以及早期胚胎丟失等，進而造成妊娠失敗。21號染色體三倍體引起的Down綜合癥患者發育遲緩、智力低下，13號染色體三倍體患者智力嚴重缺陷且伴有兔唇。染色體疾病在人群中的爆發率相當高，在新生兒中，發病率高達7.3‰，18號染色體三倍體所引發的Edward綜合癥在人群中的爆發率也高達1/2 000。研究表明，13、18、21、X和 Y染色體異常所引起的疾病占新生兒染色體疾病的85%～90%。染色體非整倍體改變是導致胚胎移植后受孕率低、胚胎著床率低且流產率高的重要原因之一［4］。異常受精胚胎因染色體非整倍體發生率較高而常被廢棄，不用于移植［5］。在IVF-ET治療過程中，約4%的患者因受精異常等原因而沒有正常受精胚胎移植，導致治療周期取消，這給患者精神上帶來很大的痛苦和壓力，同時也造成了財力及人力的大量浪費。

細胞遺傳學研究［1］顯示大部分3PN胚胎為三倍體或單倍體和二倍體的嵌合體，盡管有10%左右的3PN胚胎顯示為二倍體，但異常的紡錘體結構和數目可能導致異常的細胞分裂，從而產生高比例的復雜嵌合體胚胎，因此，3PN胚胎是不適于移植的。Manor等［6］研究發現0PN胚胎中57%(13/23)為二倍體胚胎，另外有學者通過細胞遺傳學方法發現，發生分裂的1PN胚胎中80%為二倍體，12%為單倍體，7%為三倍體［7］。0PN及1PN胚胎中的二倍體胚胎均占有較大比率。

在體外受精-胚胎移植技術中，1PN和0PN胚胎的發生率分別約為3% ～6%［8］和30% ～40%，這是一個不小的比例。多數學者認為，異常受精胚胎常存在染色體非整倍體異常，不具有移植價值［6，9］，多數中心也選擇授精第2天觀察受精原核為2PN的胚胎移植。但是，這并不代表光學顯微鏡下觀察到具有2PN及2PB的卵子被認為受精正常，其他情況就都為異常［1］。一些細胞和分子生物學研究［10-11］已經表明，某些在光學顯微鏡下觀察判斷為異常受精的胚胎實際上是正常的二倍體胚胎，即體外受精胚胎的原核數目觀察可能對胚胎移植的價值做出錯誤判斷。因此，在沒有正常受精胚胎可供移植的情況下，可選擇1PN或者0PN胚胎移植。目前已有移植1PN和0PN胚胎出生正常新生兒的報道［7，12-14］。

2 IPN及0PN的發生機制及研究進展

2.1 正常的受精過程及雌雄原核的形成 正常的受精過程包括一系列在時間上按先后順序發生的事件的綜合［1，15-17］。精子穿過透明帶后，其胞膜與卵子胞膜融合，然后遺傳物質進入卵子，此過程導致胞質釋放Ca2+產生Ca2+波，從而激活卵子［18］。卵子的激活包括釋放皮質顆粒［19］改變透明帶內層結構避免多精受精等一系列分子反應。卵子激活后，第二次減數分裂恢復并排出含有單倍體母源遺傳物質的第二極體［20］，親本染色體去凝集及選擇性的去甲基化［21］之后原核形成，其中雄原核在精子穿入點的卵膜下方形成并被母源核膜包被［15］，雌原核在第二極體分裂出來的正下方同時形成［22］。隨后，在精子中心粒的星狀體微管及微絲作用下，雌雄原核同時向卵子中央移動，直至兩原核核膜解聚，雙方染色體重組，即核融合形成二倍體胚胎［23-24］，并開始有絲分裂。

2.2 1PN發生機制及國內外研究進展 體外受精-胚胎移植周期中，1PN的發生率約為3% ～6%［8］。1PN的發生具體機制目前尚不明確，但單原核并不一定代表未受精。已有大量的研究［1］報道了1PN的細胞遺傳分析結果，這些結果一定程度上闡明了1PN的形成機制。目前認為1PN可能的發生機制有以下方面。

2.2.1 孤雌激活(parthenogenesis):1PN2PB胚胎形成的主要機制之一是孤雌激活，其原核為母源的。人類卵子的孤雌激活率較低，激活刺激源可以是鈣離子阻滯劑、蛋白激酶激活劑、電刺激和顯微注射時的機械刺激。與常規IVF(conventional IVF，c-IVF)比較，ICSI的1PN胚胎更可能是由于孤雌激活所致。Feng等［25］發現，ICSI周期中的1PN胚胎多伴有染色體異常，僅有10%的胚胎含有Y染色體，表明ICSI中單原核胚胎可能是由于孤雌生殖而非受精形成。

2.2.2 精子染色體解聚異常:精子染色體解聚異常導致雄性原核不能形成，即卵母細胞已經被注入的精子激活，但是精子自身未形成原核，這也是1PN形成的主要原因之一，大約50%的ICSI-1PN是由于這一原因造成的［26］，這些胚胎表現為1PN2PB。

2.2.3 雌性原核形成異常:雌性原核形成異常也可導致1PN，例如ICSI中將精子注入減數分裂紡錘體中會影響第二極體排出，并抑制了雌性原核形成，可導致1PNlPB 卵子［27］。

2.2.4 雌雄原核融合:Levron等［6］推測某些1PN 為正常受精胚胎，但受精提前，雌雄兩個原核已經融合為1個，或在未形成原核膜前就融合了，這樣融合的單個原核可能要大些。

2.2.5 雌雄原核形成不同步(asynchronously):原核不同步發育也是形成1PN二倍體胚胎的原因。Payne等［22］通過實時錄像記錄ICSI后卵子的原核變化，發現38%(12/32)的受精卵子的原核發育是不同步的，如果在第一次觀察后4～6 h再次觀察原核情況，約25%的1PN卵子可見第2個原核［28］。

1PN來源的胚胎中單倍體和二倍體的發生率各文獻報道不一，研究顯示IVF-1PN卵子大約50%以上是二倍體，ICSI-1PN胚胎多為單倍體，只有不到30%的1PN卵子是正常二倍體［12，28-29］。有學者通過細胞遺傳學方法發現，發生分裂的1PN胚胎中80%為二倍體，12% 為單倍體，7% 為三倍體［7］。另外，Feng［25］和Levron等［6］在研究中也發現，在 IVF周期中，50%的1PN受精卵都含有Y染色體，表明其不是孤雌激活形成的［6］，而分裂后形成的1PN胚胎經細胞遺傳學檢測，也發現通常為二倍體，提示受精正常。

ICSI-1PN與IVF-1PN的染色體組成有所不同。Catherine Staessen等［30］研究顯示IVF-1PN來源的胚胎中48.7%為二倍體，ICSI-1PN來源的胚胎中27.9%為二倍體，提示 IVF-1PN胚胎的二倍體率高于 ICSI-1PN，作者認為導致這一現象的原因可能是部份卵子受精后原核形成不同步或是已經發生原核融合。Sultan等［7］報道ICSI-1PN來源的胚胎中9.5%為二倍體，66.7%為單倍體。

盡管國內外有不少數學者研究了1PN胚胎的非整倍體發生情況［31］，但對是否選擇其進行移植一直是廣大學者爭論的焦點。有學者認為，1PN胚胎為伴有染色體異常的異常受精胚胎，不適合移植。含有單倍體遺傳物質的胚胎一般不會繼續發育或者發育不正常，即使將其進行移植，也多會發生流產、死胎、發育停止等。還有學者認為1PN來源胚胎發育潛能有限。Balakier等［32］在研究中發現，許多1PN胚胎質量較差，伴有碎片或者在2或8細胞階段發育停滯，只有30%左右的胚胎發育至桑椹胚或者囊胚階段，胚胎的囊胚形成率極低，故認為移植1PN來源胚胎沒有臨床意義，建議不移植。也有學者持相反意見，Katie Feenan 等［1］認為，部分 1PN 胚胎可培育至囊胚［14］，近年來有研究者從1PN胚胎成功地培育出了46，XX核型的人類胚胎干細胞系，以及1PN胚胎出生的健康新生兒［7，12-14］，以上幾點支持了1PN胚胎作為無其他可選胚胎進行移植的情況下作為備選胚胎的可行性。

2.3 0PN發生機制及國內外研究進展 約30% ～40%的卵子體外受精18～20 h后顯微鏡下觀察未見原核。未見到原核并不意味著未發生受精現象，繼續觀察后發現，部分0PN卵子仍會卵裂形成胚胎，其外觀形態、卵裂率與正常受精胚胎相似。發生卵裂的原因可能是孤雌激活或者正常受精。IVF授精后可出現0PN的卵子，其中大約20%可發育成形態正常的胚胎［1］。

0PN的形成機制可能包括以下幾個方面:①受精缺陷:最常見的發生原因是精子黏附和穿透機制的缺陷，或透明帶受體的缺乏使精子的穿透受到抑制，精子不能穿入卵子內造成受精失敗［14］;②正常受精，只是雌雄兩原核發育不同步，原核提前融合而過早消失，或者原核形成延遲，導致鏡下未見到原核。③Malcov等［5］通過熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)和多態標志分析發現4個0PN1PB胚胎中2個為二倍體雙雌胚胎(digynic embryo)，其機制可能是第二極體未分裂出來，而是參與到核遺傳物質的形成當中。

在臨床實踐中，因顯微鏡下觀察時未見到原核，對0PN胚胎的染色體組成存在疑問，為了避免移植染色體異常胚胎而常將此類胚胎廢棄，造成了胚胎的浪費。在患者無可選正常受精胚胎移植時，此類胚胎顯得尤為重要。Manor等［6］采用FISH方法分析了23個0PN胚胎的 13、18、2l、X、Y 染色體的非整倍體性，發現57%(13/23)0PN胚胎為二倍體胚胎，提示為正常受精，將6個這樣的胚胎移植給3個婦女，1例獲得正常妊娠。

3 對1PN及0PN胚胎研究的趨勢

從理論上講，2PN胚胎為正常的二倍體核型，但有學者通過研究發現正常受精的分裂期胚胎中有25%～40%的染色體核型異常，卵裂期發育延緩的2PN胚胎染色體異常的發生率更高［33］。因此，對于0PN及1PN這類肉眼觀察為異常受精的胚胎，可提高選擇的標準，即選擇發育速度及形態都正常者進行研究，以期最大程度的找出正常受精胚胎的所屬范疇。

具有2PB是卵子完成第二次減數分裂的標志，比1PB卵子二倍體可能性更高［1］，2PB的存在可一定程度上排除二倍體雙雌胚胎的移植。不同原核來源胚胎的染色體非整倍體發生率和非整倍體型的分布不同。如果能運用FISH等技術檢測IVF-ET周期中，源于具有高受精風險患者的發育及形態良好1PN或0PN，且具有2PB胚胎的染色體非整倍體分布并判斷其移植價值，則能更好的為臨床上在無2PN正常受精胚胎移植的情況下，是否選擇相應0PN和/或1PN胚胎移植，以及在存在有發育速度及狀態良好的0PN和/或1PN胚胎時，是否將其凍存以保存患者生殖能力或繼續培養提供理論依據，減少周期取消率，提高臨床妊娠率，更好的為病人進行治療。

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