糖尿病小鼠小腸黏膜胰島素受體的研究

張獻彩 劉秀敏 李軍改 張麗娜

(邢臺醫學高等專科學校 河北邢臺 054000)

臨床上糖尿病常引起多種消化道癥狀，病人常表現為腹瀉、便秘、上腹脹痛等癥狀[1],其發病機制尚不太清楚。現在大多數學者認為糖尿病胃腸功能紊亂的發病機制主要與胃腸的自主神經病變有關，也有臨床和實驗室研究發現在無自主神經病變時亦可出現胃腸功能紊亂[2]。但有關小腸黏膜上胰島素受體和杯狀細胞研究較少，鑒于此，利用免疫組化和PAS染色方法觀察糖尿病小鼠小腸黏膜上胰島素受體是否改變,為進一步研究糖尿病的消化系統并發癥提供證據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物來源 引進日本C57bl/ksj-db/+m轉基因小鼠。

1.1.2 動物分組 病例組：選取3、5、6、8、10月齡db/db自發性糖尿小鼠，每組6只。對照組：選取相應年齡段db/+m表型正常小鼠，每組6只。

1.2 免疫組化步驟

(1)脫蠟至水;(2)蒸餾水洗5min×3次;(3)3%甲醇-H2O2室溫孵育10分鐘，以消除內源性過氧化物酶;(4)蒸餾水洗5min×3次;(5)枸櫞酸鈉緩沖液微波爐內抗原修復約30min;(6)滴加10%正常山羊血清封閉，濕盒內孵育約10min;(7)滴加兔抗胰島素受體，濕盒內過夜;(8)0.01M PBS緩沖液洗5min×3次;(9)滴加生物素標記的二抗（羊抗兔），放入濕盒內孵育2h;(10)緩沖液洗5min×3次;(12) 滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作液，濕盒內孵育2h;(13)緩沖液洗5min×3次;(14)14DAB顯色,木精復染細胞核。

陰性對照用0.01M PBS代替一抗，其余步驟同上。結果判定：細胞內有棕黃色分布的為陽性反應。

2 結果

胰島素受體（IR）在小腸黏膜主要表達在上皮細胞的細胞膜和細胞質，在黏膜下層和肌層的細胞也有IR的表達。糖尿病組（DM）比同月份正常對照組（N）IR的表達量明顯減少(P<0.05，P<0.01)，糖尿病組中5月齡IR的表達量最高，10月齡表達的最少，并且5月齡與10月齡均存在著顯著差異（P<0.05），正常對照組隨月齡增長無顯著性差異（P>0.05）

3 討論

胰島素受體廣泛分布于全身各組織細胞內，胰島素受體是一種糖蛋白，是胰島素信號傳導通路上的連接蛋白，主要連接胰島素受體（IR）和多種效應分子。

胰島素受體由2個α亞基及2個β亞基即α2β2構成，α亞基及β亞基通過-s-s鍵相連，α亞基在細胞膜外表面，分子量130kD,由723個氨基酸構成，具有與胰島素或IGF特異結合部位，β亞基跨膜存在于胞質內，分子量95kD，由620個氨基酸殘基構成。

胰島素是胰島β細胞分泌的蛋白質激素，體內發揮重要的生理作用，必須經過以下幾步:（1）胰島素與胰島素受體α亞基結合;（2）胰島素受體β亞基中近膜結構域與胰島素受體底物結合，隨之發生一系列生化反應，使其信號得以轉導和放大;（3）產生一系列生物學效應。在上述過程中任何一個或數個環節的異常均可導致胰島素抵抗。大量資料表明2型糖尿病與胰島素抵抗有十分密切的關系[3]，學者們從各個環節研究了2型糖尿病時胰島素抵抗發生的機制，對胰島素受體這個環節也不例外，研究較多是非腸道組織如肝、脂肪組織、紅細胞等細胞上的胰島素受體的變化，但對腸道組織小腸黏膜的胰島素受體研究相對來說較少，故本研究應用免疫組化來探討糖尿病小鼠小腸黏膜上胰島素受體的蛋白表達，結果表明糖尿病時小腸黏膜上胰島素受體的蛋白表達量比同月份正常對照組降低，這與糖尿病時非腸道組織的胰島素受體變化一致，并且Ziegler,TR等研究發現大鼠小腸胰島素受體與典型的胰島素靶組織的受體完全相同，并且胰島素受體在結構上具有同源性，所以小腸黏膜的胰島素受體水平可反映胰島素受體的總體水平。糖尿病時糖尿病小鼠小腸黏膜的胰島素受體蛋白表達量減少，那么正常劑量的胰島素與其結合的數量要少，故它的生物學效應要降低，從而說明此種糖尿病小鼠存在著胰島素抵抗。

[1]李卉，劉芳,王常林,等.糖尿病腹瀉的發病機制及中西醫治療[J].長春中醫藥大學學報，2009，25（1）：50～51.

[2]Talley NJ, Young L,Bytzer P,et al.Impact of chronic gastrointestinal symptoms in diabetes mellitus on health-related quality of life[J].Am J Gastroenterol,2005,96(1):71～76.

[3]Kahn CR,Weir Gc.Joslin’s Diabetes Mellitus,Molecular Aspect of Insulin Action.13 Edition.published by lea＆Febiger Company:pressed in philished,1995,8:139.