胃腺癌組織中HDGF、VEGF的表達及意義

馬桂芳，李惠芬，楊 李

（鹽城衛生職業技術學院，江蘇鹽城 224006）

胃腺癌是中國較常見的消化道惡性腫瘤，死亡率居各種癌癥之首。近年來，隨著分子生物學的不斷發展，發現細胞增殖、凋亡異常及新生血管形成等與腫瘤的發生、發展密不可分，在這個過程中有多種因子參與或影響了腫瘤的浸潤和轉移。肝癌衍生生長因子（hepatoma derived growth factor，HDGF）是Nakamura等［1］從肝癌細胞系HuH－7培養液中分離出的一種酸性肝素結合蛋白。眾多國內外的研究表明HDGF的過表達與一些惡性腫瘤的侵襲、轉移及預后緊密相關。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前知道作用最強的促血管生長因子，它能增加血管的通透性，引起細胞外基質的改變，促進血管形成，對腫瘤細胞的增殖和遷移等發揮著重要的作用，它是獨立預后指標。本研究采用免疫組織化學方法檢測胃腺癌組織中HDGF、VEGF蛋白表達情況，為腫瘤的聯合治療尋找新的治療靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集鹽城市第一人民醫院病理科2011年1月至2011年12月手術切除并經病理檢驗證實的胃腺癌石蠟標本47例，另取同期胃黏膜不典型增生組織標本15例及因胃良性病變行部分胃切除的正常胃黏膜標本10例作對照。47例胃腺癌患者標本的選擇分別從年齡、性別、分化程度、浸潤深度、有無淋巴結轉移、TNM分期等方面考慮，所有患者術前均未接受放療、化療。

1.2 主要試劑 HDGF兔抗人多克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司產（bs－6537R），一抗工作液濃度1∶100；抗體稀釋液為北京博奧森生物技術有限公司產品；VEGF鼠抗人單克隆抗體即用型（MAB－0243）、二抗及DAB顯色液均為福州邁新生物技術公司產品。

1.3 免疫組化染色方法 采用鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶連結法（S－P）檢測胃腺癌及正常胃黏膜組織中HDGF和VEGF蛋白的表達，具體操作步驟按說明書進行。將存檔的石蠟塊行4μm厚切片，常規脫蠟至水。切片置已加熱沸騰的PH6.0檸檬酸緩沖液中，繼續微波加熱15min修復抗原，然后用3%過氧化氫去離子水37℃孵育15min，以消除內源性過氧化物酶活性。一抗37℃孵育60min，后4℃過夜，二抗37℃孵育45min，鏈霉素抗生物素過氧化物酶37℃孵育45min，DAB顯色，蘇木素復染。用已知的HDGF和VEGF陽性的胃腺癌切片染色作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定 HDGF蛋白以細胞核（少數細胞質）內出現棕黃色或棕褐色顆粒者為陽性；VEGF蛋白以細胞質內出現棕黃色或棕褐色顆粒者為陽性。每份標本置高倍鏡下選取5個不同視野，每個視野計數200個腫瘤細胞，由2位病理科醫師進行盲法判讀，計算陽性腫瘤細胞所占的百分數。結果分為4級：未見明顯陽性細胞為“－”；陽性細胞數＜25%為“＋”；25%～50%為“＋＋”；＞50%為“＋＋＋”。

1.5 統計學處理 采用SPSS19.0軟件包進行分析，HDGF與VEGF蛋白表達與胃腺癌臨床病理參數的關系用χ2檢驗，HDGF與VEGF在胃腺癌中表達相關性用Spearman進行相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HDGF、VEGF蛋白在胃腺癌和正常胃組織中的表達HDGF蛋白在胃腺癌組織中陽性染色主要定位于細胞核，少數在細胞質，為棕黃色或棕褐色顆粒（封3圖1）。HDGF在胃腺癌組織中的陽性表達率為65.9%（31／47），低級別上皮內瘤變組織33.3%（5／15），正常胃黏膜組織20%（2／10）。結果顯示，HDGF蛋白在胃腺癌組織的表達高于低級別上皮內瘤變組織（χ2＝4.970，P＜0.05）和正常胃黏膜組織（χ2＝5.383，P＜0.05）。VEGF蛋白陽性染色主要定位于細胞質，為棕黃色或棕褐色顆粒（封3圖2）。VEGF在胃腺癌組織中的陽性表達率為68.2%（32／47），低級別上皮內瘤變組織20%（3／15），正常胃黏膜組織10%（1／10）。結果顯示，VEGF蛋白在胃腺癌組織的表達明顯高于低級別上皮內瘤變組織（χ2＝11.879，P＜0.01）和正常胃黏膜組織（χ2＝10.125，P＜0.01）。

2.2 HDGF、VEGF蛋白表達與臨床病理參數的關系 胃腺癌組織中HDGF蛋白和VEGF蛋白表達都與腫瘤浸潤的深度、臨床TNM分期、淋巴結轉移相關（P＜0.05），差異有統計學意義；而與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤組織分化程度無明顯的相關性（表1）。

表1 胃腺癌HDGF與VEGF蛋白表達與臨床病理參數關系

2.3 胃腺癌組織中HDGF和VEGF表達的相關性 在31例HDGF陽性的胃腺癌組織中，VEGF陽性者25例，占80.6%；16例HDGF陰性胃腺癌組織中，VEGF陽性者7例，占43.8%，γ＝0.375，P＜0.01，相關分析表明，胃腺癌組織中HDGF蛋白的表達與VEGF蛋白表達呈正相關。

3 討 論

HDGF結構上類似于高遷移率族蛋白－1（HMG－1）的氨基酸序列。近年來，隨著對HDGF的功能研究不斷深入，發現HDGF對細胞增殖、組織器官生長發育、血管生成、創傷修復［2］等生物學行為有著重要的影響，而且在肝癌［3］、非小細胞肺癌［4］、結腸癌［5］、胃癌［6］、胰腺癌［7］、食管癌［8］等多種腫瘤中呈過表達，且與患者的預后密切相關。本研究采用免疫組織化學方法檢測胃腺癌組織、胃黏膜不典型增生組織及正常胃黏膜組織中HDGF蛋白表達情況，發現胃腺癌組織中的HDGF蛋白表達水平明顯高于胃黏膜不典型增生組織及正常胃黏膜組織中的HDGF表達，提示HDGF異常的高表達參與胃腺癌的發生和發展。Yamamoto等［6］應用免疫組織化學檢測317例胃癌組織中HDGF表達情況，研究發現胃癌組織中HDGF 1級182例，2級135例，HDGF指數水平2級病例腫瘤體積均較大，多呈侵襲性生長，血管轉移和淋巴轉移率均較HDGF指數水平1級的病例高，且HDGF指數水平2級的患者5年生存率較1級低。本研究結果顯示，胃腺癌組織中HDGF的表達水平隨患者臨床分期增加而增加，而且在伴有淋巴結轉移的胃腺癌組織中HDGF的表達明顯高于無淋巴結轉移的HDGF的表達，與文獻報道基本一致，提示HDGF蛋白高表達在胃腺癌的發生及轉移過程中可能起重要作用。

腫瘤要不斷生長，就必須有新生血管形成，而且腫瘤血管也是腫瘤轉移的病理基礎。目前，已知的促血管生成的因子有VEGF、FGF、COX－2等，其中 VEGF的作用最強，它在腫瘤新生血管形成以及腫瘤的生長、浸潤及轉移中起重要作用［9－11］。其通過誘導內皮細胞增生，蛋白酶的表達，抗內皮細胞凋亡和細胞重組，最終形成毛細血管，并且能夠增加血管的通透性，形成不成熟的血管網絡［12］。VEGF廣泛分布于體內各組織，如腦、垂體、腎臟、腎上腺和卵巢等［13］。近年來，VEGF與惡性腫瘤的關系受到重視，開展了較多研究，發現惡性腫瘤組織VEGF表達上調，能促進腫瘤血管形成，是腫瘤產生、發展和轉移過程中極為關鍵的步驟［14］。本研究結果顯示，胃腺癌組織、胃黏膜不典型增生組織及正常胃黏膜組織中VEGF蛋白表達差異有統計學意義（P＜0.01），與文獻報道基本一致，提示VEGF為腫瘤的生長提供物質基礎。

本研究結果顯示，胃腺癌組織中HDGF蛋白的表達與VEGF蛋白表達呈正相關（P＜0.05）。Okuda等［15］通過構建穩定高表達重組的HDGF的成纖維細胞株NIH3T3（HDGFNIH3T3），將HDGF－NIH3T3注入裸鼠體內后形成肉瘤，經觀察顯示此肉瘤組織中有豐富的血管形成。進一步用CD31抗體進行免疫組織化學分析顯示有新生血管生成及VEGF的表達增強，提示在胃腺癌中HDGF可能通過誘導VEGF的生成而參與腫瘤血管形成的調節，而HDGF誘導VEGF生成的機制，可能是由于HDGF能夠增強VEGF啟動子活性或直接與VEGF基因的結合域結合，促進VEGF的轉錄合成［15］。本研究與文獻報道基本一致，提示HDGF和VEGF的過表達與胃腺癌的發生、發展密切相關，可能在胃腺癌的發生、發展及轉移過程中起到協同的促進作用。

但二者之間確切的信號轉導途徑及在胃腺癌形成中的作用、地位仍需進一步研究，為胃腺癌的診斷和評價預后提供一個新的更有效的指標，也為胃腺癌的靶向治療提供新的方案。

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