蛹蟲草提取物對人結腸癌細胞SW111C抑制作用的研究

紀朋艷，羅 速，姜艷霞

（1.吉林醫藥學院醫學實驗中心，吉林 132013；2.北華大學，吉林 132013）

蛹蟲草又名北冬蟲夏草、北蟲草、蛹草等，與名貴中藥冬蟲夏草為同屬真菌植物。《全國中草藥匯編》記載:“蛹蟲草（北蟲草）的子實體及蟲體也可作為冬蟲夏草入藥”［1］。由于冬蟲夏草在自然條件下不能長期保存，加之近年來環境條件日益受到破壞和無限的人工采集，蟲草資源越來越貧乏。而目前人工栽培蛹蟲草已獲成功［2－5］，因此，對其有效成分的研究、開發具有更深的意義。國內外關于蛹蟲草提取物（RW）對結腸癌細胞的作用及機制鮮有報道。本研究通過體外實驗初步探討RW對人結腸癌細胞株SW111C的作用，為其作為一種抗癌藥物或防癌保健藥應用于臨床提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 結腸癌細胞株SW111C購自吉林省腫瘤研究所。用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中。

1.1.2 藥物與試劑 RW（由北華大學崔新穎教授所贈）用無菌二甲基亞砜（DMSO）助溶，其中DMSO的濃度小于0.1%。DMEM（低糖）培養基購自GIBCO公司，四甲基耦氮唑藍（MTT）購自 Genview公司，臺盼藍購自Sigma公司，凋亡DNA Ladder提取試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司。

1.1.3 儀器與設備 流式細胞儀（Beckman Coulter Epics XL）、二氧化碳培養箱（日本平澤制作所）、倒置顯微鏡（Olympus）、低溫超速離心機（Eppendorf 5417R型）、酶聯免疫檢測儀（南京華標儀器廠）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT法觀察RW對SW111C細胞增殖的抑制作用細胞以每孔5×103個，體積200μL接種于96孔板，37℃、5%CO2溫箱內培養24h。吸棄培養液，實驗組分別用濃度為2、4、8、16、32mg／L的RW 藥液200μL處理；陰性對照組加入完全培養液200μL；調零組加入完全培養液200μL；各設復孔3個。注意在細胞加藥后的第2天進行1／2的換液或換藥，分別培養細胞24、48、72h后，每天取一塊板，吸棄培養液，加入濃度為5g／L的MTT，20μL／孔。繼續孵育4h后吸出各孔上清液，加入DMSO 150μL／孔，振蕩10min。酶標儀以570nm為檢測波長測定各孔光密度值（A值）。細胞增殖的抑制率＝（對照組A值－用藥組A值）／對照組A值×100%。

1.2.2 臺盼藍拒染法檢測RW對腫瘤細胞的殺傷作用 培養細胞、藥物處理同MTT法，各設復孔3個。分別在48、72h后各取一塊板，對細胞進行常規消化，制備單細胞懸液。懸液均勻后，立即向一青霉素小瓶中滴入細胞懸液9滴，再滴入臺盼藍染液1滴，混勻，放置3～5min。在15min內用血細胞計數板計數200個細胞。活細胞率＝未染色細胞數／細胞總數×100%，對照組活細胞率應在90%以上。

1.2.3 瓊脂糖（DNA）凝膠電泳檢測細胞凋亡 取對數生長期SW111C細胞以8×104個／mL接種于25mL培養瓶，每瓶2mL。細胞培養過夜，陰性對照組加入相應體積的完全培養液。實驗組分別加入2、8、32mg／L的藥液，每濃度組3瓶。藥物加入72h后進行消化收集細胞。按照DNA Ladder抽提試劑盒說明書進行操作。將獲得的DNA應用20g／L DNA凝膠電泳。電泳完成后取出凝膠于紫外透射儀下觀察并照相。

1.2.4 流式細胞術（FCM）PI染色法檢測細胞凋亡率及細胞周期變化 取對數生長期的細胞以8×104個／mL接種于12孔培養板內，每孔1mL。細胞培養過夜，陰性對照組加入相應體積的完全培養液。實驗組分別加入2、8、32mg／L的藥液，每個濃度加3瓶。藥物作用72h后收獲離心，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗后再離心，70%的冷乙醇固定，4℃冰箱保存過夜。棄去70%的乙醇，用PBS漂洗后以100目篩網過濾，再離心（1000r／min，5min），棄PBS。加入PI工作液0.5mL，室溫避光30min，上機檢測。使用MultiCycle軟件分析結果。

1.3 統計學處理 采用SPSS11.5統計分析軟件，計量資料用表示。兩組均數間比較采用t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析，對抑制率與RW濃度與作用時間進行直線相關回歸分析。

2 結 果

2.1 MTT實驗結果 結果顯示RW對體外培養的SW111C細胞的生長具有抑制作用，隨著RW濃度的升高和時間的增長，其細胞增殖的抑制率明顯增加（表1）。

表1 RW對SW111C細胞抑制率的影響（，n＝3）

表1 RW對SW111C細胞抑制率的影響（，n＝3）

△:P＜0.05，＊:P＜0.01，與對照組同時間點比較。

組別抑制率（%）24h 48h 72h對照組000 RW 組（mg／L）2 2.95±1.376.96±1.6311.50±4.30＊4 3.80±1.8612.37±1.61△ 17.24±2.78＊8 8.43±1.2126.03±3.40＊ 30.11±3.52＊16 12.24±2.00△ 36.86±2.34＊ 41.30±4.72＊32 19.41±2.25＊ 45.62±1.85＊ 54.61±25.12＊

直線相關回歸分析表明，RW對SW111C細胞增殖的抑制作用具有劑量、時間依賴效應。處理24、48、72h的IC50值分別為77.78、32.19、26.20mg／L。

2.2 臺盼藍拒染法檢測結果 經RW作用48、72h后，隨著濃度的增大，SW111C細胞存活率逐漸降低（圖1）。

2.3 DNA凝膠電泳結果 RW作用72h后DNA抽提DNA凝膠電泳結果顯示，2.8mg／L RW組處理的SW111C細胞的DNA凝膠電泳圖譜未出現明顯可辨的“梯狀”條帶，32mg／L RW組的電泳圖譜出現“梯狀”條帶（圖2）。

圖1 RW對SW111C細胞存活率的影響

圖2 RW作用后細胞DNA凝膠電泳結果

表2 不同濃度的RW對SW111C細胞周期的影響（，n＝3）

表2 不同濃度的RW對SW111C細胞周期的影響（，n＝3）

＊:P＜0.01，與對照組比較。

組別細胞周期G1 S G2對照組56.7±2.5721.2±3.6322.1±3.06 RW 組（mg／L）2 63.2±1.33＊ 18.3±3.3218.5±2.518 65.7±2.48＊ 13.7±3.32＊ 20.6±2.2332 76.1±2.93＊ 11.5±2.84＊ 12.4±3.51＊

2.4 FCM檢測細胞周期和凋亡率的結果 RW作用72h后，SW111C細胞周期和凋亡率都發生了明顯的變化。隨著RW濃度的提高和作用時間的延長，G1期細胞明顯增多，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）；S期細胞明顯減少，8、32 mg／L RW組與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）；G2期細胞減少，但不明顯。說明細胞大多阻滯于G1期，并呈一定的濃度依賴性（表2）。FCM結果顯示RW作用后都發現了位于G1期前的亞G1峰，凋亡率均明顯高于對照組，差異有統計學意義，且凋亡率呈濃度相關性（表3）。

表3 不同濃度的RW對SW111C細胞凋亡率的影響（，n＝3）

表3 不同濃度的RW對SW111C細胞凋亡率的影響（，n＝3）

＊:P＜0.01，與對照組比較。

組別凋亡率（%）對照組1.9±1.3 RW 組（mg／L）26.8±2.32＊8 11.8±2.58＊32 16.9±1.93＊

3 討 論

蛹蟲草中含有多種抗腫瘤活性成分，蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、麥角甾醇、超氧化物歧化酶、硒等，并且可單獨或共同發揮抗腫瘤作用［6－11］。本研究中的RW是從蛹蟲草提取出的活性成分。MTT法和臺盼藍拒染法檢測結果顯示RW在2～32 mg／L的濃度范圍內對SW111C細胞增殖有不同程度抑制，抑制率與RW濃度和作用時間呈依賴關系。惡性腫瘤不僅是細胞增殖和分化異常的疾病，也是細胞凋亡異常的疾病［12］，細胞凋亡的減少可引起腫瘤的發生且通過逃避凋亡而促進腫瘤細胞的惡性轉化及演進［13］。因此，抗癌藥物的療效不僅取決于藥物與各自靶點的相互作用，也取決于藥物誘導細胞發生程序性死亡的能力［14］。本實驗中DNA凝膠電泳及FCM檢測結果顯示，RW可引起SW111C細胞的凋亡，且凋亡率呈濃度相關性，與MTT法測得的對增殖的抑制相一致。

本研究發現RW作用72h后可使SW111C細胞受阻于G1期，導致S期細胞降低。而腫瘤細胞增殖的快慢，主要取決于細胞G0／G1期的長短，G0／G1期短，腫瘤細胞增殖快，處于G0／G1期的細胞數少［15］，故RW對SW111C細G1期阻滯可能使細胞生長周期延長，細胞的惡性增殖減慢。

綜上所述，RW對結腸癌細胞SW111C的生長具有明顯抑制作用，且這種抑制作用呈時間劑量依賴方式。這種對增殖的抑制作用與誘導SW111C細胞凋亡、改變其細胞周期分布有關。但RW由哪些物質組成、具體哪些成分起作用等問題尚待進一步研究；另一方面，更要進行動物實驗及臨床研究，開發出低毒、高效能的蛹蟲草提取物，為人類結腸癌的防治開拓新的途徑。

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