二十二碳六烯酸對人外周血樹突狀細胞成熟的影響＊

綦曉龍，陳川寧，徐 亮，吳曉霞

（瀘州醫學院:1.附屬醫院普外科；2.生物化學及醫學分子生物學教研室，四川 瀘州 646000）

樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）被認為是目前發現的機體內功能最強大的抗原提呈細胞（antigen presenting cells，APC）。DCs能有效地激活、誘導初始T細胞，引發機體的免疫應答或免疫耐受，在免疫耐受和免疫調節中的作用日益受到廣泛關注。近年來，隨著移植免疫反應機制研究的逐步深入，人們發現DCs的成熟狀態是機體誘導移植排斥反應或誘導移植耐受的關鍵環節［1］，通過DCs誘導耐受是延長移植物存活的有效方法。研究發現，ω－3PUFAs可使大鼠DCs的CD40、CD80、CD86及MHCⅡ等表型明顯下調，其抗原提呈功能也受到明顯影響［2］。在臨床實踐中發現，ω－3PUFAs對類風濕性關節炎、潰瘍性結腸炎等多種自身免疫性疾病具有一定的治療作用，可以緩解上述疾病的病程進展［3－4］，提示其可能與自體免疫反應的抑制有關。本研究在體外以二十二碳六烯酸（DHA）處理DCs，觀察其對DCs細胞形態、免疫表型及細胞因子釋放的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 RPMI－1640購自Gibco公司；人淋巴細胞分離液（Ficoll）購自天津灝洋生物制品科技有限公司；rhGMCSF及rhIL－4購自美國Peprotech公司；DHA、飽和脂肪酸（SA）及內毒素脂多糖（LPS）購自美國Sigma公司；逆轉錄－聚合酶鏈反應（RT－PCR）試劑盒購自BioBRK公司；ELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；Wright－Giemsa染液購自南京建成生物科技有限公司；FITC標記CD80、CD86及HLA－DR單克隆抗體購自美國Sigma公司。

表1 引物序列及擴增產物

1.2 方法

1.2.1 DCs的誘導及培養 取健康成人外周血40mL，用肝素抗凝，淋巴細胞分離液（Ficoll）密度梯度離心法分離出單個核細胞（PBMC），D－Hank′s液洗滌，用含10%胎牛血清 RPMI－1640培養液懸浮細胞，接種。放置37℃、5%CO2孵箱中培養2h，吸棄細胞懸液，洗去非貼壁細胞，獲得貼壁的單個核細胞。加入含10%胎牛血清RPMI－1640完全培養基、rhGM－CSF、rhIL－4使其終濃度為:rhGM－CSF 500U／mL，rhIL－4250 U／mL。隔日半量換液，誘導5d。

1.2.2 DCs的處理和分組 將細胞分為4組，分別為未成熟組、成熟組、DHA組及SA組（飽和脂肪酸對照組），并行細胞爬片。分別將DHA和SA（均以50%乙醇溶解）加入相應組的培養基中，使其終濃度為50μmol／L，未成熟組和成熟組則分別加入相應劑量的乙醇作為平衡。第6天（脂肪酸作用24h后），除未成熟組外，各組分別加入LPS 100μg／L誘導DCs成熟，第8天（LPS作用48h后）收集各組細胞進行相關指標的檢測。

1.2.3 形態學檢測 培養第8天時在細胞爬片中加入95%乙醇固定15min，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍，Wright－Giemsa染色，顯微鏡下觀察，攝片。

1.2.4 ELISA測定IL－12p70及TNF－α水平 收集各組細胞培養上清液，每組至少3復孔。取出酶標板，依照次序對應分別加入50μL的標準品于空白微孔中；分別標記樣品編號，加入50μL樣品于空白微孔中；在樣品孔中加入10μL生物素標記液；在標準品孔和樣品孔中加入50～100μL酶標記液；37℃孵育反應60min；在孔板搖床上用洗滌液清洗5次，每次靜置10～20s；每孔加入底物（顯色劑）A、B液各50μL；37℃下避光孵育反應15min；每孔加入50μL終止液終止反應。于酶標儀上以波長450nm測定各孔的OD值。實驗重復3次，取3次實驗的平均值。

1.2.5 DCs表面相關表型的檢測 將不同時期的DCs用PBS調至4×105個／mL，加入離心管，每管200μL，加FITC標記的CD80、CD86和 HLA－DR單抗，4℃ 標記30min后，PBS洗滌，用600μL LPBS重懸細胞待測。

1.2.6 RT－PCR檢測 DCs中 CD80、CD86、HLA－DR mRNA的表達 RT－PCR步驟:（1）提取總RNA，冰上收集細胞加入1 mL冰TRNzol勻漿，依次經氯仿、異丙醇等抽提總RNA。（2）RT反應體系20μL，總RNA XμL（＜1μg），RNase free H2O（11－X）μL，5×RT Buffer 4μL，dNTP Mixture（10mM）2μL，Super－RI 0.5μL，RT－Enhancer 0.5μL，Oligo（dT）18 （50 pmol／μL）1μL，ReverTra Ace 1μL。反應條件:30℃10min，42℃30min，99℃5min，4℃5min。（3）PCR反應體系20 μL，RT產物2μL，RNase free H2O 6μL，2×Taq PCR Master－mix 10μL，上、下游引物（10pmol／μL）各1μL。反應條件:94℃預變性2min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸60 s，30個循環，72℃后延伸5min。反應結束后，取10μL PCR產物與上樣Buffer混勻，與PCR－Marker一起，在含1mg／mL溴化乙錠的3%瓊脂糖凝膠中電泳，在紫外透射儀下觀察結果。電泳結果采用凝膠圖像分析系統觀察并照相，黑馬凝膠圖像分析系統分析電泳圖像，以目的基因擴增量／內對照（人GAPDH）基因擴增量表示所要檢測基因的表達量，見表1。

2 結 果

2.1 DCs形態學觀察 鏡檢顯示，PBMC呈圓形，胞體小，黏附貼壁生長。由GM－CSF、IL－4及LPS聯合誘導的DCs細胞體積漸漸增大，細胞形態也不斷發生變化，由圓形變成梭形、星形或不規則形，胞漿變得豐富，細胞膜伸出很多不規則突出，并聚集成簇。培養8d的成熟組及SA組細胞呈現典型的DCs形態，胞體大，不規則，胞膜向外伸出毛刺狀或樹突狀突起，呈半貼壁生長；DHA組則與未成熟組細胞形態類似，見圖1。

圖1 各組培養后DCs經Wright－Giemsa染色光鏡觀察結果（×400）

2.2 流式細胞儀（FCM）檢測 誘導第8天后，DCs經流式細胞儀檢測成熟組CD80、CD86及HLA－DR平均熒光強度明顯上調；其余3組無顯著差異。但是在其成熟過程中給予DHA干預后呈明顯下調，結果見表2。

2.3 DHA對DCs分泌細胞因子水平的影響 以PBS為空白，以各標準OD值及對應濃度制作IL－12p70及TNF－α標準曲線，IL－12p70回歸計算公式為Y＝0.0012 X＋0.22，直線相關系數（r2）為0.9792；TNF－α回歸計算公式為Y＝0.0009 X＋0.0952，直線相關系數（r2）為0.9924。ELISA結果顯示，成熟組與未成熟組相比，IL－12p70和TNF－α水平明顯提高。但是在其成熟過程中給予DHA干預，其產生的IL－12p70和TNF－α的水平則明顯下調，見表3、圖2。

表2 各組CD80、CD86及HLA－DR的平均熒光強度（，%）

表2 各組CD80、CD86及HLA－DR的平均熒光強度（，%）

△:P＜0.01，與未成熟組比較；▲:P＜0.01，與成熟組比較。

項目 未成熟組 成熟組 DHA組 SA組CD80 52.7±4.397.8±3.7△ 56.8±4.2▲58.6±5.3 CD86 55.0±3.496.1±1.3△ 60.5±3.8▲ 62.4±4.7 HLA－DR 80.4±7.698.6±3.6△ 81.6±4.6▲79.8±7.5

表3 各組IL－12p70和TNF－α的含量（，pg／mL）

表3 各組IL－12p70和TNF－α的含量（，pg／mL）

△:P＜0.01，與未成熟組比較；▲:P＜0.01，與成熟組比較。

項目 未成熟組 成熟組 DHA組 SA組IL－12p70189.7±16.3768.1±62.7△ 412.6±62.6▲709.5±47.8 TNF－α 637.6±38.42405.7±125.5△ 1807.4±140.3▲2353.4±194.7

圖2 各組IL－12p70及 TNF－α的含量（pg／mL）

2.4 DHA對DCs中CD80、CD86、HLA－DR mRNA表達的影響 CD80、CD86、HLA－DR的PCR擴增產物分別與各自GAPDH的PCR擴增產物相比，結果顯示:CD80（F＝182.324，P＝0.000）、CD86（F＝104.611，P＝0.000）、HLADR（F＝205.319，P＝0.000）的4個組之間均有顯著差異（P＜0.01）；成熟組與未成熟組相比，有顯著差異（P＜0.01）；DHA組CD80、CD86及HLA－DR mRNA表達與成熟組相比均有所減低（P＜0.01），說明DHA可有效抑制 DCs中CD80、CD86和HLA－DR mRNA的表達，而SA組CD80、CD86和 HLADR mRNA表達與成熟組比較無明顯變化（P＞0.05），見圖3。

圖3 DHA對DCs表達CD80、CD86和HLADR mRNA的影響

3 討 論

DCs是目前發現的功能最強大的APC，最大的特點是能顯著刺激初始型T細胞增殖［5］。而其他APC僅能刺激已活化的或記憶性T細胞，因此，DCs是機體免疫反應的始動者，在免疫應答中具有獨特的地位。成熟DCs表達高水平的共刺激分子CD80、CD86，它們與T細胞受體CD28結合，傳導正性共刺激信號，以激活初始型T細胞并促進細胞因子IL－12的分泌［6］。而未成熟DCs只有低水平的MHCⅡ類分子表達，同時缺乏刺激T細胞活化必需的輔助分子CD80、CD86等，體外激發混合淋巴細胞反應極弱，也不能誘導初始T細胞活化。隨著免疫抑制治療的進展，器官移植取得了很大進步，但目前應用的免疫抑制是以犧牲機體整體免疫功能為代價，且有不良反應［7］，尋找新型的免疫抑制劑和誘導受者對供者抗原的特異性耐受是當前移植學急需解決的問題。

DCs是專職的APC，是眾所周知的高效APC，許多研究已經證實DCs在決定耐受和免疫的平衡上起著關鍵的作用［8］。ω－3多不飽和脂肪酸中的DHA在體外可以顯著抑制DCs共刺激分子CD80、CD86以及表面抗原提呈分子HLA－DR的表達，從而干擾了DCs與T細胞之間的共刺激作用，使T細胞無法激活。所謂的成熟狀態不僅僅是對DCs功能的描述，還包括了它的表型特征。比如，當DCs表面高表達 MHC分子、CD40、CD80、CD83、CD86等時，它就被認為是成熟［9］。這是因為DCs表面的分子與其對T細胞活化的能力是密切相關的，從免疫學的角度來講，一旦DCs表面分子的表達達到了成熟的“標準”，DCs也就進入了成熟的功能狀態［10－11］。

DHA還可以抑制DCs細胞釋放細胞因子IL－12和TNF－α。IL－12p70是DCs成熟過程中分泌的一種標志性的重要細胞因子，它能夠促進Th0細胞分化為Th1細胞，從而誘導Th1細胞介導的免疫反應［12－13］。本研究結果顯示DHA使DCs分泌IL－12p70的水平降低至接近未成熟DCs水平。TNF－α是一種全身性炎癥反應和免疫反應介質，DHA明顯抑制DCs分泌TNF－α，抑制抗原特異性T細胞增殖，是DCs誘導外周耐受的一種可能機制［14－15］。而DCs對Th1／Th2應答平衡的調節是決定移植物排斥或耐受的另一重要機制之一［16－17］。因此，可以認為DHA從細胞免疫表型的表達和細胞因子的釋放2個方面抑制了DCs對T細胞的激活能力。而SA在本實驗中并未發現對DCs有明顯影響［18］。

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