蘇木治療大鼠膜性腎病的實(shí)驗(yàn)研究

胡克杰，趙學(xué)謙，宋成收，3

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150086;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150086;3.齊齊哈爾市第一人民醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

膜性腎病(membranous nephropathy，MN)常表現(xiàn)為腎病綜合征，病變的主要特征是腎小球基底膜增厚，腎小球毛細(xì)血管壁的上皮細(xì)胞下有沉積物，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是一種原位免疫復(fù)合物形成致病。國內(nèi)10 594例腎活檢病理資料分析顯示，原發(fā)性腎小球疾病中MN占第3位(9.54%)，且近10年來明顯增多。蘇木是我國傳統(tǒng)中藥材，主要含有黃酮類化合物和甾醇類化合物等，研究證實(shí)，其免疫抑制作用略強(qiáng)于雷公藤多甙，與環(huán)孢霉素A的對照研究表明其有抗免疫排斥作用，而無明顯的毒副作用。本實(shí)驗(yàn)以MN大鼠模型為研究對象，觀察蘇木對其生化指標(biāo)、病理組織及細(xì)胞因子的影響，并與雷公藤多甙等做比較，研究蘇木對MN的干預(yù)作用及其可能機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量150～200g之間(購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院動物實(shí)驗(yàn)中心)，于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性馴養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)期間自由攝食、飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及主要試劑 蘇木為水提取物(預(yù)制成的顆粒沖劑，批準(zhǔn)文號0610081，三九醫(yī)藥公司);雷公藤多甙片(黃石飛云制藥有限公司);強(qiáng)的松(河南天方藥業(yè)股份有限公司);天然牛血清白蛋白(NBSA，河北博海生物工程有限公司);大鼠白介素18定量酶檢測試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物分組及模型復(fù)制 隨機(jī)挑選大鼠10只作為正常對照組(A組)，其余40只用于復(fù)制模型。模型組大鼠使用C－BSA 1mg，加入0.5ml PBS中，與等量的弗氏不完全佐劑混勻成乳白色懸液，在雙側(cè)腋下、腹股溝作多點(diǎn)皮下注射。預(yù)免疫1周后，每只大鼠尾靜脈注射 C－BSA 2.5mg(溶于1ml pH 7.4 PBS中)，每周3次，共3周。成功造模后，隨機(jī)分為4組:模型組(B組)，蘇木組(C組)，雷公藤多甙組(D組)，強(qiáng)的松組(E組)。

1.4 給藥方法 A、B組:每只大鼠每日給予生理鹽水1ml灌胃;C、D、E組每只大鼠每日分別給予蘇木0.5g、雷公藤多甙片1mg、強(qiáng)的松1ml等容灌胃，均給藥4周。

1.5 檢測指標(biāo) 觀察各組大鼠精神狀態(tài)、活動情況等一般情況變化，24h尿蛋白排泄量的變化，血清BUN、Cr、TG、TC、ALB 等生化指標(biāo)的變化。

1.6 大鼠IL－18定量酶檢測 采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。

1.7 腎臟病理檢測 腎臟組織用4%多聚甲醛中固定過夜;流水沖洗標(biāo)本6h后，酒精梯度脫水;置60℃蠟箱浸蠟4h，包埋蠟塊;30%明膠涂片，涼干;切片，烤片;脫蠟至水;蘇木素及伊紅染色;染色后脫水，透明;中性樹膠封片;鏡下觀察腎臟病理改變。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 造模后約1周均出現(xiàn)精神不振，反應(yīng)遲鈍，活動量少，攝食減少，尿量減少等現(xiàn)象。第4至6周，模型對照組出現(xiàn)皮下、陰囊水腫及腹水。第7、8周，C、D、E組大鼠狀態(tài)較前略好轉(zhuǎn)，攝食逐漸增加，體重增長，腹水、陰囊水腫明顯消退。

2.2 生化指標(biāo)改變 血清BUN、Cr水平5組間無明顯差異。模型組TG、TC較正常組均明顯上升(P＜0.05)，ALB水平較正常組明顯下降(P＜0.05)。各治療組治療后TG水平與正常組相比均有升高，經(jīng)藥物治療后下降，但與模型組相比差異無顯著性。各治療組治療后的TC水平明顯低于模型組(P＜0.01)，基本恢復(fù)正常。治療組的低蛋白血癥在治療后有顯著改善(P＜0.01)。各治療組間各項(xiàng)指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠生化指標(biāo)的變化(s，n=10)

表1 各組大鼠生化指標(biāo)的變化(s，n=10)

注:與正常組比較，△P＜0.05;與模型組比較，*P＜0.01。

組別指標(biāo) 正常組 模型組 蘇木組 雷公藤組 強(qiáng)的松組BUN(mmol/L)7.01 ±0.87 7.27 ±0.86 7.22 ±0.90 7.53 ±0.67 7.28 ±0.84 Cr(umol/L)71.54 ±6.85 77.58 ±7.45 75.42 ±5.63 76.20 ±5.52 75.26 ±5.71 TG(mmol/L)1.14 ±0.12 1.82 ±0.24△ 1.48 ±0.50 1.54 ±0.45 1.68 ±0.38 TC(mmol/L)2.12 ±0.43 3.89 ±0.45△ 2.42 ±0.53* 2.40 ±0.29* 2.51 ±0.35*ALB(mmol/L)40.60 ±3.42 25.76 ±2.54△ 30.36 ±2.87* 31.22 ±1.74* 30.98 ±2.69*

2.3 24h尿蛋白排泄量變化 實(shí)驗(yàn)第8周末與第4周末比較，模型組尿蛋白定量稍有回落，但差異無顯著性;各治療組尿蛋白定量與治療前比較有明顯降低(P＜0.01);第8周末各治療組與模型組比較有顯著差異(P＜0.05)，即治療組尿蛋白水平顯著低于模型組，各治療組間兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表2。

表2 大鼠24h尿蛋白定量(U－TP)的檢測結(jié)果(s)

表2 大鼠24h尿蛋白定量(U－TP)的檢測結(jié)果(s)

注:與治療前(4周末)組比較，*P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05。

組別 n 4周末 8周末正常組10 6.10 ±1.54 6.60 ±1.78模型組 10 182.20 ±5.26 183.40 ±10.35蘇木組 10 182.40 ±4.92 120.20 ±5.76＊△雷公藤組 10 181.25 ±4.50 118.30 ±4.45＊△強(qiáng)的松組 10 182.55 ±5.30 122.00 ±4.20＊△

2.4 各組大鼠IL－18水平變化 模型組及治療組血IL－18水平均顯著高于正常組(P＜0.01)，各治療組血IL－18與模型組比較均降低(P＜0.05)，但各治療組間相比無明顯差異。結(jié)果見表3。

表3 大鼠白介素18定量酶檢測結(jié)果(s)

表3 大鼠白介素18定量酶檢測結(jié)果(s)

注:與正常組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05。

組別 n IL－18(ng/L)正常組10 52.64 ±3.26模型組 10 145.18 ±2.07＊＊蘇木組 10 98.02 ±2.82＊△雷公藤組 10 97.93 ±2.54＊△強(qiáng)的松組 10 100.57 ±3.09＊△

2.5 腎臟組織學(xué)改變 模型組腎小球體積明顯增大，球內(nèi)細(xì)胞增多，毛細(xì)血管壁明顯增厚，管內(nèi)出現(xiàn)較多紅細(xì)胞，腎小球周圍大量炎性細(xì)胞浸潤，分葉明顯，基底膜彌漫性增厚，系膜細(xì)胞增生，腎小管近曲小管水腫。治療組腎小球體積改變不明顯，球內(nèi)細(xì)胞數(shù)不同程度減少，以激素組明顯，浸潤的炎性細(xì)胞也相應(yīng)減少。蘇木組和雷公藤組表現(xiàn)相似，毛細(xì)血管內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)明顯減少，腎小球周圍僅有少量炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織學(xué)改變

3 討論

據(jù)國內(nèi)腎活檢病理結(jié)果報告，MN占成人原發(fā)性腎小球腎炎的8.8% ～11.9%，居第3位［1］，是導(dǎo)致慢性腎衰竭的主要原因之一。目前普遍認(rèn)為，MN的發(fā)病機(jī)制為上皮下免疫復(fù)合物沉積所導(dǎo)致的基底膜增厚和足細(xì)胞損害，基底膜的損害正是局部形成的原位免疫復(fù)合物沉積的結(jié)果［2－3］。本研究采用C－BSA免疫大鼠的方法成功復(fù)制MN模型，其發(fā)病機(jī)制、病變穩(wěn)定而典型，病理變化較一致。

幾乎所有腎臟固有細(xì)胞，包括系膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等都有產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力，并且同時又是細(xì)胞因子生物學(xué)活性的靶細(xì)胞［5］。IL－18是近年來發(fā)現(xiàn)的具有多種免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，有許多生物學(xué)活性:刺激T細(xì)胞增殖;誘導(dǎo)T細(xì)胞和自然殺傷NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN－γ;使T細(xì)胞分泌IL－2、GM －CSF和TNF－α;誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞表達(dá)Fas配體等。IL－18在MN中的作用機(jī)制主要可能為:增強(qiáng)Thl免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用［5］;促進(jìn)血管通透因子(VPF)表達(dá)［6］;導(dǎo)致在功能上Thl/Th2的比例失調(diào)等［5］。

近年來藥理及臨床研究證實(shí)，蘇木在免疫的細(xì)胞和分子水平均有抑制作用［7－8］，另外尚有抗炎、改善微循環(huán)［9］、抗氧化［10］等作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，通過干預(yù)治療后，蘇木組和激素組尿蛋白定量均明顯低于模型組，提示蘇木可以減少M(fèi)N蛋白尿，從而延緩腎病的進(jìn)展;蘇木組血清ALB明顯高于模型組，表明蘇木能提高M(jìn)N大鼠的血漿蛋白水平，其原因可能與減少蛋白尿，改善肝臟的白蛋白合成和增加白蛋白的攝入，從而提高了血漿白蛋白的水平有關(guān);蘇木組病理改變程度明顯減輕，可見蘇木能抑制膜性腎病大鼠的系膜細(xì)胞增生，減少免疫復(fù)合物形成，從而延緩腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程;此外，還可能通過增加腎血流量，提高腎小球?yàn)V過率，改善其微循環(huán)，或部分調(diào)節(jié)組織的修復(fù)與再生，從而修復(fù)部分受損腎臟組織。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組IL－18水平顯著升高，與各治療組存在顯著差異，而蘇木組與其他治療組之間IL－18的表達(dá)并無明顯差異，說明三種治療均具有抑制IL－18分泌的作用，蘇木與強(qiáng)的松組、雷公藤多甙相比并無優(yōu)勢。而蘇木抑制IL－18分泌的作用具體機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步的探索與研究。

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