促甲狀腺素受體基因D727E多態性與甲狀腺相關性眼病的相關性研究

尹曉艷 閆春芳 孫斌

甲狀腺相關性眼?。╰hyroid-associated ophthalmopathy,TAO）是一種與多種因素相關的常見的眼眶疾病[1]，是以眼球后及眶周組織的浸潤性病變為特征的自身免疫性疾病,是引起成人眼球突出的最常見原因。近些年來，許多國內外的專家學者對TAO進行了研究，在發病機制和診斷方法上，取得了一定的進展，但是由于樣本大小、研究人群以及地域的不同,各研究結論不同。目前普遍認為是遺傳因素、免疫學因素及外界環境共同作用產生。國內外研究表明,基因的多態性可能與TAO的發病有關。由于TAO常伴隨GD發生，很多患者血清促甲狀腺素受體抗體（anti-thyrotropin receptor antibody,TRAb）含量增高[2]，因此促甲狀腺素受體（TSHR）成為TAO自身抗原的研究首選。然而，TSHR與TAO的作用機制還不是很明確。目前國內外尚未見TAO和TSHR多態性關系的文獻報道。本研究旨在探討TSHR基因與TAO的關系，并采用PCR-RFLP方法研究TSHR基因D727E多態性與TAO的關系，為TAO的預防及治療提供重要的實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 TAO組：51例，男20例，女31例；年齡9～65歲，平均（39.98±14.84）歲。病程1月～19年，平均（1.69±3.19）年，樣本均來自山西醫科大學第一及第三醫院眼科確診的患者，納入標準為1979年美國甲狀腺協會(American Thyroid Association,ATA)制定的診斷及分級標準[3]，患者均經甲狀腺功能測定、眼部B超或CT檢查排除了其他疾病所導致的突眼,并且有專人測量其雙眼突出度[4]；GD組：55例，男24例，女31例;年齡13～78歲，平均（34.33±9.501）歲。病程1月～11年，平均（2.83±4.21）年，納入標準為《內科學》第7版Graves病[5]。CON組：60例，男24例，女36例，年齡12～76歲，平均（41.67±10.36）歲，為山西醫科大學第一醫院健康體檢中心篩選的無自身免疫性及感染性疾病的健康人群，年齡、性別與病例組相匹配。所有患者及健康對照者均為山西地區漢族人，并簽署了知情同意書。

1.2 臨床檢查 一般檢查：包括詳細詢問病史及全身體檢。

眼部常規檢查：包括視力、外眼、屈光系統、眼底和眼球運動。眼球突出度檢查采用Hertel突眼計檢查。根據我國正常人眼球突出度標準：雙眼球或單眼球突出度>14mm，或雙眼球突出度相差≥2mm者，為眼球突出（除外生理性或假性突出）。用復視圖檢查分析眼外肌功能。部分患者行眼眶CT、B超檢查，分析眼外肌、視神經及眶內病變狀況，以協助診斷。

1.3 TSHR D727E多態性研究方法 （1）基因提取 抽取空腹靜脈血2ml，EDTA-K2抗凝，用飽和酚-氯仿三步法提取外周血DNA。（2）引物合成 引物由上海生工生物工程技術服務公司合成。上游引物：5’-CCATTCCTCTATGCTATTTTCAC-3’；下游引物：5’-CCGTTTGCATATACTCTTCTG-3’[6]。（3）PCR擴增反應 反應體系40ul，由8ul基因組DNA，4ul 10×Buffer，0.8ul 10×dNTP，3.2ul 25mmol/L MgCl2，0.06ul上游引物，0.06ul下游引物，0.32ulTaq酶，24ul去離子水組成。循環參數：94℃預變性5min，94℃變性45s，61.6℃退火45s，72℃延伸45s，循環35次，72℃終末延伸10 min。目的基因片段長度為265bp。（4）酶切：擴增產物經限制性內切酶NlaⅢ酶切后經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在紫外透射儀下觀察條帶。

1.4 統計學方法 運用Hardy-Weinberg平衡法則檢驗樣本的群體代表性。用SPSS19.0統計軟件分析各組等位基因和基因型頻率，組間比較用χ2檢驗，顯著性檢驗水準а=0.05。

2 結果

2.1 TSHR D727E位點酶切產物電泳結果 TSHR D727E位點野生型（CC）片段為160bp、84bp和21bp 3個片段；純合變異型（GG）片段為181bp和84bp 2個片段；雜合變異型（GC）片段為181bp、160bp、21bp和84bp 4個片段，如圖1。

圖1 TSHR D727E位點酶切產物電泳結果。M:marker;4、5、6、7野生型CC;3純合變異型GG;1、2、8、9雜合變異型GC。

2.2 TSHR D727E位點等位基因頻率與基因型的分布 G等位基因頻率：TAO組（28.4%）GD組（15.5%）CON組（5.8%），χ2=21.020，а=0.000<0.05，表明G等位基因頻率三組之間有差異。兩兩比較，TAO組與GD組，χ2=5.246，а=0.022<0.05；TAO組與CON組，χ2=20.723，а=0.000<0.05；GD組與CON組，χ2=5.684，а=0.017<0.05。表明此三組兩兩之間G等位基因頻率差異均有統計學意義，TAO組G等位基因頻率（28.4%）明顯高于GD組（15.5%）及正常對照組（5.8%）；GD組G等位基因頻率（15.5%）明顯高于正常對照組（5.8%）。

GG+GC基因型頻率：TAO組(47.1%)GD組(25.5%)CON組(10.0%)，χ2=19.482，а=0.000<0.05，表明GG+GC基因型頻率三組之間有差異。兩兩比較，TAO組與GD組，χ2=5.371，а=0.020<0.05；TAO組與CON組，χ2=19.196，а=0.000<0.05；GD組與CON組，χ2=4.771，а=0.029<0.05。表明此三組兩兩之間GG+GC基因型頻率差異均有統計學意義，TAO組GG+GC基因型頻率（47.1%）明顯高于GD組(25.5%)及正常對照組（10.0%）；GD組GG+GC基因型頻率(25.5%)明顯高于正常對照組（10.0%），如表1。

表1 TSHR D727E基因型及等位基因頻率分布

3 討論

TSHR是一種跨膜性蛋白，屬于G蛋白偶聯受體，體內主要分布在甲狀腺濾泡細胞膜上[7]。研究表明TSHR是許多自身免疫性甲狀腺疾病(auto immune thyrod disease,AITD)主要的自身抗原之一。在生理狀態下，促甲狀腺素(TSH)通過TSHR而影響甲狀腺細胞的生長、分化和功能的發揮。病理狀況下，TSHR又是TRAb攻擊的靶，是引起甲狀腺機能亢進(甲亢)的自身抗原[8]。TSHR的主要功能為與TSH結合，通過腺苷酸環化酶- cAMP途徑發揮生理作用。若編碼TSHR的序列發生了變異，可引起TSHR蛋白結構和免疫源性改變，導致自身抗體產生，包括針對甲狀腺刺激性(TSAb)或阻斷性(TBAb)等抗體。在GD時,TSAb可抑制Fas在TEC的表達,從而抑制Fas/FasL引起的TEC凋亡,參與GD甲狀腺腫的形成[9]。但TBAb的產生是否與TSHR基因突變有關的問題頗有爭議,仍需要進一步的研究[10]。

編碼人TSHR的基因位于14號染色體長臂(14q13)，全長超過60kb，約含58000堿基對，有10個外顯子，9個內含子。第1至第9外顯子編碼TSHR的細胞外功能區，而跨膜區及細胞內區則由單個巨大的始基型第10個外顯子編碼[11]。到目前為止，已發現TSHR基因上膜內區的D727E(Asp-Glu)的改變與GD相關，但各家報道的結論相去甚遠。目前國內外尚未見TAO和TSHR多態性關系的文獻報道。

本研究以TSHR為候選基因，采用PCR-RFLP方法探討TSHR基因D727E多態性與山西地區部分漢族人TAO易感性的關系。其結果顯示：G等位基因頻率及GG+GC基因型頻率三組之間有差異，此三組兩兩之間差異均有統計學意義，TAO組G等位基因頻率及GG+GC基因型頻率明顯高于GD組及正常對照組；GD組G等位基因頻率及GG+GC基因型頻率明顯高于正常對照組。表明TSHR基因D727E位點的G等位基因與TAO及GD的發生相關。由此，從基因學的角度我們支持TSHR是甲狀腺和眼眶受累組織共同抗原的學說。此結果與梁軍等人研究結論不一致[12]，他們認為漢族人TSHR受體基因與GD無相關性。

目前不同研究中存在的許多不一致現象，可能是由于遺傳易感因素的異質性造成的。通過對不同群體的基因型-表現型相關性分析，可揭示遺傳異質性在疾病發生、發展中的作用。因此有很多的問題尚需我們進一步探討、研究和改進。

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