四君子湯加減顆粒對腹腔巨噬細胞吞噬功能及ND和IBD疫苗免疫效果的影響

張桂枝，羅永煌，侯春彬，靳雙星

（1.西南大學藥學院，重慶 北碚 400715；2.鄭州牧業工程高等專科學校畜牧系，河南 鄭州 450011；3.重慶市獸藥工程技術研究中心，重慶 北碚 400716）

近年來，由于病毒的變異、免疫抑制疾病的存在、不合理的疫苗接種以及應激等因素，導致畜禽傳染病疫苗免疫效果不佳，給養殖業造成巨大的經濟損失。因此，如何激活機體的免疫系統、提高機體的免疫力、增強機體的抗病能力，一直是國內外學者關注的焦點。中藥以其毒性低、副作用小、多靶點、病原微生物對其不易產生耐藥性等優點引起人們越來越多的關注，尤其在免疫抑制性疾病和增強機體免疫機能方面中藥發揮著巨大的作用［1-5］。四君子湯由人參、白術、茯苓和甘草四味中藥組成，主治脾胃氣虛。本課題組依據畜牧生產和獸醫臨床特點，將四君子湯中的人參改為具有明顯免疫增強作用的黃芪［6-7］，同時加入具有清熱解毒及免疫增強作用的板藍根、連翹［8-9］以及健脾消食的山楂和理氣消食的枳實，按處方中各藥所含有效成分的理化性質，分別采取醇提、水提和蒸餾的方法，提取中藥有效組分，制備成中藥復方顆粒劑，考察其對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能以及肉用仔雞免疫雞新城疫（ND）疫苗、傳染性囊病（IBD）疫苗后血清ND及IBD抗體效價的影響，旨在為獸醫臨床及生產應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 四君子湯加減顆粒的組成及制備 四君子湯加減顆粒由黃芪、白術、茯苓、甘草、板藍根、連翹、山楂和枳實組成。先用乙醇提取連翹的醇溶性有效組分。白術、枳實采用蒸餾法提取揮發油。連翹、白術和枳實的藥渣，與黃芪、茯苓、甘草、山楂、板藍根混合，水煎2次，合并水煎液濃縮至比重1.10（溫度60℃），加入乙醇沉淀水溶性組分中的雜質，濾液與連翹的醇提液混合，經濃縮制備流浸膏，再與一定量的蔗糖粉混合制軟材，制濕顆粒，干燥，整粒，最后將白術、枳實的揮發油噴灑在整粒后的顆粒表面，適度混勻、陰干即得（1g顆粒相當于原生藥1.4g）。

1.1.2 主要試劑 ND Clone-30疫苗、ND-LaSota油乳劑滅活苗、ND標準濃縮抗原、ND標準陽性血清；IBD凍干苗、IBD標準瓊擴抗原、IBD標準陽性血清等。

1.1.3 試驗動物 昆明系小鼠，體重18～20g。1日齡健康AA肉仔雞，隔離飼養至所需日齡，選取360只發育均勻的健康雞供試驗用。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的測定［10］將40只小鼠隨機分為4組，每組10只。第1組為對照組，正常飲水；第2、3、4組為試驗組，飲水中分別加入0.3%、0.6%、0.9%的四君子湯加減顆粒，連用5d。試驗前4d，每只小鼠每天腹腔注射1次6%可溶性淀粉肉湯1mL。第5天，給小鼠腹腔注射1%雞紅細胞懸液1mL；30min后，再給小鼠腹腔注射1mL生理鹽水并輕柔腹部；20min后脫頸法處死小鼠，用注射器吸取腹腔液少許制成薄推片。瑞士染色鏡檢，計算吞噬百分率和吞噬指數。吞噬百分率＝吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數／巨噬細胞總數×100；吞噬指數＝巨噬細胞吞噬的雞紅細胞總數／吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數。

1.2.2 雞血清中ND和IBD抗體效價的測定

1.2.2.1 試驗動物分組 選取7日齡、10日齡和14日齡的非免疫健康雞各120只。各日齡雞只分別分為4組，每組30只，第1組為對照組；第2、3、4組為試驗組，免疫的同時，飲水中分別加入0.3%、0.6%、0.9%四君子湯加減顆粒，連用3周。每組隔離飼養，各組雞的飼料成分及飼養管理方式完全相同。

1.2.2.2 試驗動物處理 7日齡4組雞按2羽份／只點眼、滴鼻 ND Clone-30疫苗，在免疫前、14、21日齡及28日齡，各組分別隨機抽取7只雞，采血，分離血清測定ND抗體效價。10日齡4組雞頸部皮下注射ND油乳劑滅活苗0.3mL／只，在免疫前、17、24日齡及31日齡，各組分別隨機抽取7只雞，采血，分離血清測定ND抗體效價。14日齡4組雞按2羽份／只滴口IBD疫苗，在免疫前、21、28日齡及35日齡，各組分別隨機抽取7只雞，采血，分離血清測定IBD抗體效價。

1.2.2.3 血清中ND抗體效價的測定 采用微量紅細胞凝集抑制（HI）試驗測定，抗體效價的高低用血清陽性最高稀釋倍數（nlog2）表示。

1.2.2.4 血清中IBD抗體效價的測定 采用瓊脂擴散沉淀反應 （AGP）測定，抗體效價的高低用血清陽性最高稀釋倍數（nlog2）表示。

1.2.3 數據分析 用SPSS軟件統計進行分析。

2 結果與分析

2.1 四君子湯加減顆粒對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響 由表1可見，小鼠飲用四君子湯加減顆粒后，試驗組腹腔巨噬細胞的吞噬百分率和吞噬指數均顯著高于對照組（P＜0.05）；第3、4兩組均顯著高于第2組（P＜0.05）。第3、4兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。

表1 四君子湯加減顆粒對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響

2.2 四君子湯加減顆粒對ND Clone-30疫苗免疫效果的影響 由表2可見，免疫前（即7日齡）各組的ND抗體效價無顯著差異（P＞0.05）。免疫后的3個日齡階段，第3、4兩組的抗體效價均顯著高于第2組和對照組（P＜0.05），第3、4兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。

表2 四君子湯加減顆粒對ND Clone-30疫苗免疫效果的影響

2.3 四君子湯加減顆對ND油乳劑滅活疫苗免疫效果的影響 由表3可見，免疫前（即10日齡）各組的ND抗體效價無顯著差異（P＞0.05），免疫后的3個日齡階段，試驗組的ND抗體效價均高于對照組，但在第17日齡，第2組抗體效價與對照組比較無顯著差異（P＞0.05）。第3、4兩組的ND抗體效價顯著高于第2組和對照組（P＜0.05）。第3、4兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。

表3 四君子湯加減顆粒對ND油乳劑滅活疫苗免疫效果的影響

2.4 四君子湯加減顆粒對IBD疫苗免疫結果的影響 由表4可見，免疫前（即14日齡）各組的IBD抗體效價無顯著差異（P＞0.05）。在28日齡和35日齡試驗組的IBD抗體效價均顯著高于對照組（P＜0.05），第 3、4 兩 組 顯 著 高 于 第 2 組 （P＜0.05），第3、4兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

四君子湯加減顆以益氣健脾和胃為主，兼以清熱解毒、消導理氣。其中黃芪、白術補中益氣，茯苓健脾利水，板藍根、連翹清熱解毒兼有扶正作用，枳實行氣，山楂健脾消食，甘草調和諸藥。

表4 四君子湯加減顆粒對IBD疫苗免疫結果的影響

現代免疫學研究證明，動物體內的巨噬細胞在維持機體自身穩定中起重要作用，巨噬細胞既能特異性地吞噬多種病原微生物，也能有效地清除體內損傷、衰老、死亡的細胞，還能殺傷腫瘤細胞，并且有處理和傳遞抗原信息的作用。通過調節淋巴細胞的應答機能參與體內的免疫，因此，對巨噬細胞的檢測是衡量機體免疫功能的重要指標。本試驗中以淀粉肉湯培養液刺激小鼠腹腔，能提高巨噬細胞產率和純度；以雞紅細胞作為抗原，具有體積大、特征顯著，易于識別等優點，可較準確地鑒定巨噬細胞的吞噬作用。本試驗結果表明，四君子湯加減顆粒能夠提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬活性，增強機體免疫功能，發揮扶正祛邪的作用。

體液免疫是由抗原刺激B淋巴細胞，引起B淋巴細胞活化、增殖與分化，形成漿細胞并產生抗體，抗體效價的變化反映了機體的體液免疫狀態。本試驗結果表明，四君子湯加減顆粒分別與ND Clone-30疫苗、N D油乳劑滅活苗和IBD凍干苗合用，均可使雞血清ND和IBD抗體效價高于或顯著高于對照組，顯示出四君子湯加減顆粒可明顯增強這3種疫苗的免疫效果。

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