表觀健康的豬肉攜帶豬鏈球菌的調查

臧瑩安，謝樂新，李家僑，龐木生，李 淼，宋 帥，李春玲

（1.仲愷農業工程學院動物科學系，廣東 廣州 510225；2.廣東省農業科學院獸醫研究所 廣東省獸醫公共衛生公共實驗室，廣東 廣州 510640；3.廣東省動物疫苗供應站，廣東 廣州 510225）

豬鏈球菌病（SS）是由豬鏈球菌引起的人獸共患傳染性疾病，給養豬業及公共衛生安全構成了嚴重的威脅。人和豬感染發病的臨床癥狀相似。以往對豬肉進行食品安全檢測的項目多集中在致瀉大腸桿菌、沙門菌、單增李斯特菌等食源性病原菌，檢測過程中，偶爾也能分離到鏈球菌，但多數是沒有致病性的［1-2］。在經濟高度發達的時代，食品安全越來越成為人們關注的焦點，本次通過對廣州大型農貿市場銷售的屠宰豬肉的隨機抽樣，初步了解表觀健康的豬肉攜帶豬鏈球菌的情況和耐藥性情況，為防范食源性豬鏈球菌病感染人及耐藥性的傳播提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 PCR儀，DYY-5型穩壓穩流電泳儀，全自動數碼凝膠圖像分析系統-Tanon-1600，Fast win臺式離心機Fc-16c，SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺，HZQ-X100震蕩培養箱，均購自杭州博日科技有限公司。

1.2 主要試劑 新生牛血清，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；血平板，購自廣東環凱微生物科技有限公司；托-休二氏液體培養基（Todd-Hewitt broth，簡稱THB）和托-休二氏固體培養基（Todd-Hewitt Agar，簡稱THA）均為自行配制。豬鏈球菌分型試劑盒、藥敏試驗紙片和豬鏈球菌乳膠凝集標準診斷試劑盒，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

根據豬鏈球菌2型溶血素基因設計引物，PCR引物序列為：GTTGAGTCCTTATACACCTGTT，CAGAAAATTCATATTGTCCACC

1.3 樣品的采集 2010年7～8月，在廣州某大型農貿市場集中采集樣品66份，用消毒后的手術刀切開豬肉暴露切口，再用滅菌棉簽拭豬肉的新鮮切口，放入裝有1mLTHB液體培養基的試管中，于37℃恒溫搖床180r／min中震蕩培養18h。

1.4 豬鏈球菌的分離 在超凈工作臺中采用劃線分離培養法用接種環挑取菌液接種于血平板上，37℃培養14～16h，經培養無雜菌者，選取α溶血、光滑圓形、半透明、直徑1～2mm的小菌落，每個樣品挑去3～6個疑似菌落，分別接種3mL THB培養基中，37℃培養16～18h后，仔細觀察分離菌經培養后的生長情況，并挑取單個可疑菌落和液體培養物分別作革蘭染色鏡檢。

1.5 豬鏈球菌的PCR鑒定 利用16SrRNA的PCR檢測豬肉中的豬鏈球菌，具體步驟如下。

PCR擴增采用25μL反應體系。在反應管中依次加入 10×PCR Buffer 2.5μL、25 mmol／L MgCl22.0μL、2.5 mmol／L dNTPs 2.0μL、10 pmol／μL引物1.0μL、模板1.0μL、5U／μL Taq酶0.5μL，然后加ddH2O調整終體積至25μL。94℃變性5min后進入循環，94℃0s，60℃1min，72℃1.5min，35個循環后72℃保溫10min。將得到的PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳。取6.5μL PCR產物和1μL 6×Buffer上樣緩沖液充分混勻置2.0%瓊脂糖凝膠 （含溴化乙錠替代物Goldview）電泳。電壓5V／cm，電流130mA，用凝膠成像儀觀察結果并拍照。

1.6 豬鏈球菌的生化試驗 將分離的菌株接種于THB培養基中37°C培養16～18h，用1mL滅菌注射器各吸取0.05～0.08mL（約1～2滴）的菌懸液加入每種微量發酵管。放于37℃培養箱中培養24h。記錄結果。

1.7 豬鏈球菌的血清分型 分離出來的豬鏈球菌，采用凝集的方法進行分型［3］。

1.8 豬鏈球菌的分群 按豬鏈球菌乳膠凝集標準診斷試劑盒說明書進行。

1.9 豬鏈球菌的藥敏試驗 采用紙片擴散法進行［4］。

2 試驗結果

2.1 豬肉中豬鏈球菌的陽性率 66份表觀健康的豬肉，經PCR擴增確定9份為豬鏈球菌陽性樣品，總體陽性率為13.6%。

2.2 豬鏈球菌的生化試驗 分離到的9株豬鏈球菌發酵乳糖，血清菊糖，棉子糖，七葉苷，水楊素，海藻糖；不發酵6.5%NaCl，馬尿酸鈉，甘露醇，山梨醇。

2.3 豬鏈球菌的血清型分型結果 9株豬鏈球菌采用凝集的方法進行血清型分型，確定其中8型，9型，18型，26型各1株，27型3株，32型2株。

2.4 豬鏈球菌的分群結果 9株豬鏈球菌分群的結果：確定5株是C群，4株是D群。

2.5 豬鏈球菌的藥敏試驗結果 見表1。

表1 藥敏試驗結果 （mm）

由表1可知，分離到的9株鏈球菌對12種抗菌藥物呈現不同程度的耐藥性，且以多重耐藥為主。鏈球菌對同一種藥物的敏感性有很大的差異，總體來說分離的菌株對頭孢唑啉，先鋒Ⅵ ，阿莫西林，氟苯尼考，奧復星高度敏感；對青霉素中度敏感；對強力霉素，四環素，新霉素，菌必治，復方新諾明和磺胺異惡丙唑耐藥。

3 討論與分析

本次從廣州某大型農貿市場采集了66份表觀健康的豬肉，采用PCR的方法進行檢測，豬鏈球菌的陽性率達到了13.6%。此次試驗不同于其他試驗從豬的扁桃體，脾臟或者血液中檢測豬鏈球菌的攜帶情況，而是考慮到食品的安全和人體健康，直接從表觀健康的豬肉中進行豬鏈球菌檢測的。2010年從上海屠宰豬扁桃體中調查豬鏈球菌感染率，取樣231份樣品中共確定24份豬鏈球菌，陽性率達到10.4%［5］。相比之下，屠宰豬扁桃體和表觀健康的豬肉中豬鏈球菌的陽性率基本一致，說明豬鏈球菌的攜帶方式不僅僅是內臟或者血液，豬肉中也同時攜帶豬鏈球菌。豬鏈球菌是急性熱性人獸共患傳染病，而豬肉作為日常生活中不可或缺的肉制品，為了保證食品的安全和人體的健康，確實是有待加強豬鏈球菌病的監測和防控工作。

生化試驗的結果是能發酵乳糖，血清菊糖，棉實糖，七葉苷，水楊素，海藻糖；不發酵6.5%NaCl，馬尿酸鈉，甘露醇，山梨醇。從生化試驗的結果來看，這與其他省、市所報道的豬鏈球菌主要流行群基本一致，本試驗驗菌株的生化特性與其他報道［6-7］沒有區別，生化指標可作為細菌鑒定的一個參考。同時也佐證了PCR方法作為豬鏈球菌鑒定方法的準確性和精確性。

豬鏈球菌的血清型有1～34型和1／2型，共35種血清型［8］，在分離到的陽性的菌株采用血清凝集試驗進行血清分型，確定其中8型，9型，18型，26型各1株，27型3株，32型2株。雖然這次試驗并沒有發現嚴重危害人類健康的2型豬鏈球菌，但是從豬肉中檢出2型豬鏈球菌的例子是屢見不鮮。2007年從非法屠宰的豬肉中檢出豬鏈球菌2型，由公安部門和獸醫衛生監督部門查獲和送檢的，推斷在屠宰前該批豬就已感染豬鏈球菌2型，或是屠宰前就是豬鏈球菌2型病死豬，送檢時豬肉可能受到血液或實質器官污染［9］。

本次從豬肉中分離到的9株豬鏈球菌對12種抗菌藥物的敏感性有一定的差異性，呈現不同程度的耐藥性，且以多重耐藥為主。總體來說分離的菌株對頭孢唑啉，先鋒Ⅵ，阿莫西林，氟苯尼考，奧復星高度敏感；對青霉素中度敏感；強力霉素，四環素，新霉素，菌必治，復方新諾明和磺胺異惡丙唑呈耐藥。此次的試驗說明，豬鏈球菌都產生多重耐藥性。這給臨床治療帶來了很大的困難，嚴重威脅著人類和動物的生命及健康安全，也給新藥的開發帶來了巨大的壓力。建議豬場在防治豬鏈球菌病時，對菌株進行藥敏試驗，根據試驗結果用2～3種敏感藥物按療程和足夠的劑量交替使用。

［1］李春玲，余煒烈，王貴平.豬鏈球菌扁桃體分離株的毒力因子分布特征與致病性［J］.中國預防獸醫學報，2009（2）：645-648.

［2］倪艷秀，何孔旺，王繼春，等.檢測豬鏈球菌2型的溶菌酶釋放蛋白（MRP）的PCR方法的建立［J］.中國預防獸醫學報，2001，23（1）：20-22.

［3］高志勇，莊輝.人-豬鏈球菌病研究進展［J］.中華流行病學雜志，2005（9）：645-648.

［4］陳澤祥，吳禮結，許力干，等.廣西豬源鏈球菌分離株的分群鑒定［J］.中國畜牧獸醫，2005，32（12）：38-40.

［5］Han D U，Choi C，Ham H J，et al.Prevalence，capsular type and antimicrobial susceptibility of Streptococcus suis isolated from slaughter pigs in Korea［J］.Can J Vet Res，2001，65（3）：151-155.

［6］王麗平，陸承平，唐家琪.鏈球菌對大環內酯類抗生素的耐藥性及耐藥表型［J］.南京農業大學學報，2004，27（4）：81-84.

［7］閆若潛，趙明軍，張志凌，等.河南省致病性豬鏈球菌血清型及耐藥性狀況調查［J］.河南畜牧獸醫，2007，28（5）：25-27.

［8］田云，孫彥偉.豬鏈球菌鑒定方法的研究進展［J］.廣東畜牧獸醫科技，2006，31（4）：6-8.

［9］李小軍，張蘇華，劉佩紅，等.從非法屠宰的豬肉中檢出豬鏈球菌2型［J］.畜牧與獸醫，2007，39（8）：45-48.