犬精液冷凍液的優化試驗

沈留紅，楊慶穩，何 橋

（四川農業大學動物醫學院，四川 雅安 625014）

1969年Seager（美國）使用冷凍精液成功以來，犬冷凍精液即成為犬繁殖生理學研究的一部分。發達國家犬的冷凍精液研究與推廣起步早，發展快。但在我國養犬業中冷凍精液的研究和應用還不廣泛，這不僅制約了中國犬良種化的進程，同時也增加了成本。目前，犬冷凍精液解凍后的活率僅在0.4左右，精子復蘇率、活力和存活時間也相對較低［1］。筆者通過對不同配方的稀釋液、添加不同劑量的不同維生素對解凍后精子活力影響的試驗，試圖找到一種優良稀釋液，達到提高冷凍精液精子活率的目的，為進一步在生產當中提高冷凍精液的品質提供一定參考。

1 試驗材料

1.1 試驗動物 昆明系狼犬5只，體重20～30kg，年齡2～8歲，健康，體況良好。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試驗試劑 三羥甲基-氨基甲烷（Tris）、雙輕乙基-氨基乙烷磺酸（BES）、葡萄糖、乳糖、果糖、檸檬酸、甘油、青霉素、鏈霉素、卵黃、姬姆薩染液、伊紅-苯胺黑死活染色液、維生素B12、維生素C、復合維生素B等。

1.2.2 試驗儀器 電光生物顯微鏡、細胞計數器、恒溫箱、離心機、液氮罐、pH值試紙等。

1.3 試驗地點 四川農業大學獸醫產科和胚胎工程基地實驗室。

1.4 試驗動物處理 試驗前2周進行犬瘟熱、細小病毒疫苗免疫，適應性單籠飼養，主要以玉米、魚粉、豆粕、谷皮等為主要原料的配合飼料附以少量生肉及牛雜等定時、定量、由固定飼養員常規飼喂，自由飲水，采精后每只犬補食兩枚生雞蛋。

2 試驗方法

2.1 精液的采集 用拇指和食指握住犬陰莖，輕拉包皮，將龜頭球握在手掌內并給予適當壓力，待陰莖充分勃起，用集精漏斗收集精液。

2.2 精液品質的常規檢查

2.2.1 精液的氣味與色澤的檢查 無異味、乳白色或淡乳白色者為正常精液；否則均為不正常。

2.2.2 精液的pH值檢查 取一小滴精液用pH值為5.0～8.4的精密試紙測定。

2.2.3 精子活力的檢查 將精液置于37℃的顯微鏡下，放大400～600倍鏡檢，用10級評分法作初步評分。進一步用伊紅-苯胺黑死活染色法檢測（活精子不著色）。

精子活率＝呈直線運動精子數／總精子數×100%

2.2.4 精子密度的測定（血細胞計數法） 血細胞計數法［2］，在400倍顯微鏡下目測活力，將精液用生理鹽水20倍稀釋后用血細胞計數板計算密度。

2.2.5 頂體完整率 用姬姆薩染色法［3］，滴壓制片，在1000倍顯微鏡下檢測（活精子不著色）。

精子頂體完整率＝頂體完整型精子數／精子總數×100%

2.2.6 精子畸形率的檢查 用姬姆薩染色法［3］，每樣品做兩個涂片。在每片左右二個不同部位各數100個精子，用血細胞計數器記錄下每個部位的畸形精子數；每樣品兩個涂片的平均畸形精子數，代表此精液樣品的畸形精子數。

畸形率＝（片1左右部畸形總數＋片2左右部畸形總數）／400×100%

2.3 精液的稀釋 根據原精子的活力、密度等因素采用一步稀釋法對精液進行稀釋。稀釋前，先將稀釋液預熱到38℃左右。試驗中一般將精液密度保持在1.0×108／mL左右，不應過高，這樣有利于解凍后精子活力的檢測。稀釋液現配現用，配好后搖勻，1000r／min離心20min。

在大量預備試驗的基礎上，篩選出效果較好的稀釋液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其配方見表1。

表1 稀釋液配方

2.4 精液的降溫與平衡 把稀釋好的精液包上8～16層紗布，轉移到4℃的恒溫環境中。

2.5 犬顆粒凍精制作 用泡沫塑料改制成炸熏盒，內設兩室：一室內上置銅紗網，下盛液氮，并設一蓋子，為“熏室”；另一室內可直接盛放液氮，為“炸室”。將平衡后的精液直接滴于炸室內液氮中，滴后靜置5～8s，在移入熏室中加蓋熏蒸6min，收集裝袋，浸入液氮。

2.6 精液的解凍 將試管預熱到35℃～40℃，從液氮罐內取出顆粒精液迅速投入試管內，輕輕搖動，待顆粒融化到2／3時，即從水浴中取出，繼續搖動使其全部融化。

3 試驗結果

3.1 不同稀釋液類型對解凍后精子頂體完整率、活率和畸形率的影響 見表2。表2所示，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種稀釋液制作的凍精解凍后活率均大于30.00%，Ⅰ液的凍后平均活率最高，但Ⅰ液和Ⅱ液差異不顯著（P＞0.05），都與Ⅲ液差異顯著（P＜0.05）；頂體完整率和畸形率Ⅰ液優于Ⅱ、Ⅲ液，差異顯著（P＜0.05），Ⅱ液與Ⅲ液之間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同稀釋液類型對解凍后精子頂體完整率、活率和畸形率的影響

3.2 添加不同劑量的維生素B12對解凍后精子頂體完整率、活率和畸形率的影響 選用組方Ⅰ添加不同劑量的維生素B12作為冷凍液，表3可知，隨著維生素B12量的增加，解凍后精子活率、精子頂體完整率變化不大，差異均不顯著（P＞0.05），畸形率以12 mL組和16mL組較低，與其他組差異顯著（P＜0.05）。3.3 添加不同劑量的復合維生素B對解凍后精子頂體完整率、活率和畸形率的影響 復合維生素B（每2mL含維生素B120mg，維生素B22mg，維生素B62 mg，煙酰胺30 mg）的添加如表4可知，4 mL／100mL組的活率平均高于其他組，與對照組和6mL／100mL、8mL／100mL差異顯著（P＜0.05），頂體完整率與精子活率的結果相似，而精子畸形率以8mL／100mL組最高，與其他組差異顯著（P＜0.05），4 mL／100 mL、2 mL／100 mL 組 最 低 在23.58%～24.15%范圍內，與其他組差異顯著（P＜0.05）。

表3 添加不同劑量的維生素B12對解凍后精子頂體完整率、活率和畸形率的影響

表4 添加不同劑量的復合維生素B對解凍后精子頂體完整率、活率和畸形率的影響

3.4 添加不同劑量的維生素C對解凍后精子頂體完整率、活率和畸形率的影響 不同維生素C（0.25 g／2mL）濃度量添加精子平均活率4mL／100mL組高于其他組（見表5）與8mL／100mL差異顯著（P＜0.05），同其他添加組及對照組差異不顯著（P＞0.05）。頂體完整率以4mL／100 mL、6 mL／100mL組最高，分別為74.58%±1.59%、74.39%±1.78%，兩組間差異不顯著（P＞0.05），二者均與其他組差異顯著（P＜0.05）。精子畸形率以對照組最高31.81%±2.30%，加入維生素C后，畸形率有所降低，其中6mL／100 mL組最低為25.57%±2.49%，與對照組差異顯著（P＜0.05）。

表5 添加不同劑量的維生素C對解凍后精子頂體完整率、活率和畸形率的影響

4 分析與討論

4.1 選擇不同的冷凍稀釋液對于犬冷凍精液的品質起著十分關鍵的作用［4］，試驗證明，篩選出的3種稀釋液均能較好的保持精子的活力，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三組稀釋液制作的冷凍精液解凍后的活率均大于30.00%，稀釋液Ⅰ組的活率為最高達到了43.35%±0.85%，3者均達到了可用于AI凍精的最低標準，對精子復蘇后各項指標進行分析，說明這3種配方均能在犬精液冷凍生產中使用。這3種稀釋液中的Tris和檸檬酸鈉的作用機理是調節精液的pH值，使精子的存活時間延長［5］。對精子的保護作用較為明顯。而Ⅰ、Ⅱ組之間的精子活力無顯著差異（P＞0.05），說明這兩種稀釋液對犬精子的保護效果基本相同。其中葡萄糖、果糖、卵黃等提供營養，以補充精子所消耗的能量。一些分子能滲透精子膜到細胞內，參與精子代謝，給精子提供外源性能量，減緩內源性物質的消耗，從而延長精子在外界的存活時間［6］。在前人研究的基礎上，本試驗均加入了甘油作為超低溫保存防低溫打擊物質，卵黃和糖類在一定程度上也起到了這種作用。由于精液和稀釋液都是營養豐富的物質，是細菌等微生物孿生的適宜環境，它們的存在與繁殖在精液保存過程中可能直接影響到精子活率，所以抗生素的添加必不可少，一般常常加入青霉素和鏈霉素，可以達到有效的抗陰性菌和陽性菌的作用。

4.2 通過3種維生素的添加發現，明顯提高凍精解凍后的精液品質，利于精液冷凍保存［7］。精子呼吸代謝產生的活性氧族，可氧化精子細胞質膜上的不飽和脂肪酸，使質膜發生不可逆的氧化損傷，喪失流動性，使細胞內酶缺失，引起DNA損傷。維生素B12作為輔酶能使氧化型（-S-S-型）谷胱甘肽還原成還原型（-SH-型），-SH-型的谷胱甘肽能還原活性氧族，減少精子質膜的氧化損傷，保護精子質膜的完整性［8］；從試驗結果可以看出，解凍后精子活率平均值都高于對照組，但差異均不顯著（P＞0.05），而且隨著維生素B12量的增加，活率變化不大。試驗結果表明，添加復合維生素B的量為4mL／100mL較理想，但其活率與對照組差異不顯著（P＞0.05），頂體完整率最高，精子畸形率最低，與對照組差異顯著（P＜0.05）。但添加復合維生素B后能提高犬精液凍后精子活率的理論依據并不清楚，其復雜性和不穩定性還有待于進一步的研究；維生素C一方面作為抗氧化劑清除細胞呼吸而產生的活性氧離子，從而保護精子不受由于冷凍而產生的自由基毒害；另一方面維生素C可促進包括細胞內維生素E在內的一些其他抗氧化劑物質生成［8］。本試驗結果得出，4mL／100mL的維生素C精子活率最高，但與對照組差異不顯著（P＞0.05），頂體完整率最高，精子畸形率低，與對照組差異顯著（P＜0.05），說明適量添加維生素C能保護精子頂體，降低畸形率；而過量添加（8mL／100mL）時，品質會降低，可能是因為維生素C是酸性抗氧化劑，過量添加會使稀釋液pH值降低、滲透壓增大，使精子的頂體和質膜受到損傷。

5 結語

5.1 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種稀釋液制作的凍精解凍后活率均大于30.00%，Ⅰ液的凍后平均活率最高，但Ⅰ液和Ⅱ液，差異不顯著（P＞0.05），Ⅲ液最低，差異顯著（P＜0.05）；頂體完整率和畸形率Ⅰ液均優于Ⅱ、Ⅲ液，差異顯著（P＜0.05），Ⅱ液與Ⅲ液之間差異不顯著（P＞0.05）。Ⅰ號稀釋液為本試驗中最佳稀釋液，其冷凍精液解凍后活率可達43.35%±0.85%。

5.2 在稀釋液中添加維生素B12，對解凍后精子的活率、精子頂體完整率變化不大，但平均值都高于對照組，并且隨著維生素B12量的增加，精子畸形率有繼續降低趨勢。

5.3 添加復合維生素B、維生素C對昆明系狼犬精子均有較好的保護作用，但其添加量并非越多越好，以復合維生素B 4mL／100mL、維生素C 4mL／100 mL添加為宜。

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