瘤胃真菌體外產纖維素酶條件的篩選

厲學武，王利華，孫艷朋

（青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109）

纖維素類物質是自然界中存在的最廉價、最豐富的一類可再生資源。然而纖維素分子形成緊湊的、富含氫鍵的、嵌入在植物細胞壁的微纖維，所以纖維素很難被利用［1］。纖維素酶可以將纖維素降解為單糖，因此提高纖維素酶產量和活力是解決纖維素利用的重要前提。

自從Orpin 1975年發現厭氧真菌以來，國內外學者研究表明，厭氧真菌可分泌高活性纖維素酶、木聚糖酶和酯酶等多種酶，并在植物纖維降解中起著重要作用［2］。目前從瘤胃中分離得到的真菌共計6個屬10余個種之多，所有已分離出的瘤胃真菌都具有溶解纖維的特性，并且都具有降解植物細胞壁中結構性碳水化合物的能力［3］。研究還發現，瘤胃真菌首先分離木質化的纖維組織，從而為細菌利用與木質素結合的纖維物質創造條件。雖然細菌是瘤胃內主要分解纖維的微生物，但瘤胃真菌壁降解的貢獻可能遠遠超過細菌。通過對發酵后植物片段殘余物的比較表明，瘤胃真菌對厚壁組織的降解顯著高于瘤胃細菌［4］。

瘤胃真菌產生的木聚糖酶比瘤胃主要的纖維分解細菌產生的酶活力高5倍，比原蟲和目前工業上常用的產纖維素木酶菌Thichoderma reesei菌株C-30等工業用產酶的微生物分泌的酶活力均高［5］。本試驗采用L9（34）正交試驗，通過測定木聚糖酶和羧甲基纖維素酶活以篩選嶗山奶山羊瘤胃真菌產酶的最優發酵條件，提高瘤胃真菌產酶活性，為纖維素酶的研發提供應用基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株 瘤胃液取自裝有永久性瘤胃瘺管的成年嶗山奶山羊。采食后2h，經瘤胃瘺管從瘤胃抽取瘤胃液，放入充滿二氧化碳的大離心管中，10mL的瘤胃液加入液體培養基（含有1000IU／mL的青霉素；1600μg／mL的鏈霉素，以抑制細菌生長），稀釋10倍進行培養，制成真菌混合懸浮液用于接種。

1.2 試驗設計 試驗分別采用L9（34）正交表，氮源分別為（NH4）2SO4、NH4Cl和尿素；接種量分別為5mL、10mL和15mL（液體培養基的量分別為95mL、90mL和85mL）；培養基起始pH值分別為7.0、6.0和5.0；發酵溫度分別為35℃、37℃和39℃，共9個試驗組，每個試驗組設3個 重復。每組玉米秸稈的用量為80mg／mL。

1.3 試驗方法 液體培養基參照朱崇淼［6］的配制。NaHCO35.0g、葡萄糖1.0g、酵母膏1.0g、蛋白胨1.0g、緩沖液A 165mL緩沖液B 165mL、無細胞瘤胃液170mL、蒸餾水500mL。每1L緩沖液A中含KH2PO43g、NaCl 6g、（NH4）2SO43.9g、CaCl2·2H2O 0.4g、MgSO4·7H2O 0.6g，以蒸餾水作溶劑。每1L緩沖液B中含K2HPO4O3H2O 4 g，以蒸餾水作溶劑。培養基中加入1mL 0.1%刃天青作為厭氧指示劑。上述培養基配制好后通入CO2至飽和（溶液顏色由暗紅色變為透明的黃色）后分裝，分裝前半小時加入0.15%L-半胱胺酸鹽酸鹽。無細胞瘤胃液的制備：取新鮮瘤胃液，用雙層紗布過濾后，在4000r／min離心30min，取離心上清液。

試驗用液體培養基則不含有葡萄糖，而是按0.1%添加CMC-Na。

1.4 測試項目與方法 在發酵結束，從各培養瓶中抽取適量發酵液上清液，測木聚糖酶活力及纖維素酶活力。將各培養瓶中發酵液經坩堝（坩堝己稱重）真空過濾，底物殘留及附著的菌體在坩堝中于105℃烘至恒重，計算底物的干物質消失率。木聚糖酶活力和羧甲基纖維素酶活力的測定均參照文獻［7］。每分鐘每mL酶液釋放1μmol／L木糖（葡萄糖）的酶量為1個酶活單位（U）。參照張龍翔等［8］主編的生物實驗方法和技術中的Bradford方法測定比活力。每分鐘每毫克蛋白釋放1μmol／L木糖（葡萄糖）的酶量定義為1個酶比活力單位（μ／mg·Protein）。

1.5 統計方法 采用Excel 2007對數據進行整理，并對正交試驗結果的K和R值進行測定，干物質消化率采用Spss Statistics 18軟件進行多重比較，數據采用平均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 木聚糖酶 從表1的R值分析可知，影響試驗結果的因素依次為D＞C＞B＞A，即對木聚糖酶活力的影響因素依次是發酵溫度、培養基起始pH值、接種量及N源。從K值可以看出，A1B1C1D1組合木聚糖酶活力最高為8.34U／mL，即 （NH4）2SO4作為N源，接種量為5mL，發酵起始pH值＝5，發酵溫度35℃的發酵組合最佳；A2B2C3D1組合木聚糖酶比活力最高為26.39U／mg。

表1 木聚糖酶活測定結果

2.2 羧甲基纖維素酶 從表2的R值分析可知，影響試驗結果的因素依次為A＞B＞D＞C，即對羧甲基纖維素酶活力的影響因素依次是N源，接種量、發酵溫度及培養基起始pH值。從K值可以看出，A1B3C3D3組合羧甲基纖維素酶活力最高為0.225U／mL，即 N源為 （NH4）2SO4，接種量為15 mL，培養基起始pH值為7，發酵溫度39℃的組合酶活力最高，A3B2C1D3組合羧甲基纖維素酶比活力最高為0.253U／mg。

2.3 不同發酵底物DM降解率 以玉米秸稈為發酵底物，培養96h后其干物質降解率見圖1。干物質降解率為34.6%～43.5%，處理4、5組和6組（NH4Cl組）的真菌發酵干物質消失率顯著低于其他各處理組［（NH4）2SO4和尿素組］（P＜0.05）。

表2 羧甲基纖維素酶活力測定結果

圖1 各處理組玉米秸的干物質降解率

3 討論

厭氧真菌瘤胃真菌可產生纖維素分解酶、半纖維素分解酶（主要是木聚糖降解酶）、果膠酶、酯酶等13種酶。Lee等［9］曾報道，瘤胃厭氧真菌產生的木聚糖酶的酶活力比目前工業用木聚糖酶制劑生產菌米曲霉（Aspergillus oryzae）所產木聚糖酶的酶活力高3倍。朱崇淼等［10］研究厭氧真菌粗酶的木聚糖酶活力為7.89U／mL，劉煥明［11］報道，黑曲霉p14菌株木聚糖酶最優酶活力5.25 U／mL。Tripathi等［12］報道，12株厭氧真菌的羧甲基纖維素酶活力在160～231mU之間。這些結果均表明，瘤胃厭氧真菌是迄今所報道的產酶活力較高的菌株之一。

在試驗中，以秸稈為發酵底物的的木聚糖酶活力為8.34 U／mL，稍低于國內已報道的鏈霉菌（streptomyces sp.str z-6）所產木聚糖酶活力（9.77 U／mL）［13］。羧甲基纖維酶活力為0.225U／mL，低于孟會生［14］和于紅霞等［15］報道的結果。一方面說明在試驗條件下，篩選發酵條件有進一步優化的可能性，另外一方面對于纖維素酶活力的檢測應規范化，以便不同的研究的結果能有可比性。從發酵底物的干物質消失率看，干物質消失率最低的組（4組、5組和6組與木聚糖酶和羧甲基纖維素酶酶活力并不同步，說明還存在著沒有被測定的纖維素酶，對纖維素的降解發揮著作用。5組的最高的木聚糖酶的比活力，進一步說明，該組的木聚糖酶的純度高，則酶的種類相對少，在粗纖維降解上并無優勢。

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